Name: use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells
Uploaded: 2012-10-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Biz protokol düzenleme yardım Mariani laboratuar üyeleri ederim. Bu çalışma CIRM Doktoraüstü Eğitim Grant (JLF), bir CIRM KÖPRÜLER staj (TZTT), Robert E. ve Mayıs R. Wright Vakfı (FVM) ve Güney Kaliforniya Üniversitesi (FVM) tarafından finanse edildi.

1. Fare Embryolarının LysoTracker Boyama <ol><li> Erkek damızlık kafesi içine genç (5-6 haftalık) kadın koyarak fare embriyoları oluşturun. Bu çiftleşme gösteren bir vajinal fiş görünümü için aşağıdaki sabahları Monitör oluştu. Kadın hamile ise, o gün öğlen 0.5 DPC (gün sonrası çiftleşme) denir. Burada sunulan prosedür embriyolar 7-13 DPC için idealdir. </li><li> Ilgi embriyonik gününde, onaylı protokollere göre kadın ötenazi ve rahim kaldırmak. Hanks BSS (fenol kırmızısı olmadan) ile 10 santimetrelik bir petri tabağına desidua dan embriyolar çıkarın. Ekstra embriyonik membranlar çıkarın ve en az bir gereksiz doku ve kan kaldırmak Hanks BSS ile yıkayın yok. </li><li> LysoTracker Embriyo Boyama Çözüm (Hanks BSS 5 mM LysoTracker) hazırlayın. 1-2 litre için uygun bir hacmi 5 ml &#39;dir. Yavaşça eşit boya dağıtacak karıştırın. </li><li> LysoTracker Embriyo Boyama Solut embriyo ekle45 dakika için bir mikrofüj tüpü ya da 37 ° C &#39;de ve flakon inkübe iyon. </li><li> Hanks BSS çok yavaşça dört kez, 5 dakika, her yıkama yıkayın. </li><li> Gecede 4% Paraformaldehyde düzelt. </li><li> Düzeltmesini kaldırmak için, Hanks BSS, 10 dakika içinde bir kez yıkayın. </li><li> Arka plan boyama ortadan kaldırmak için bir metanol serisi (% 50,% 75,% 80,% 100, 5 dk her adımda) aracılığıyla kurutmak. Bu görüntüleme sırasında iyi sinyal-gürültü elde etmek için önemlidir. </li><li> Bu noktada ışıktan koruyarak, -20 ° C&#39;de metanol içinde süresiz embriyo örnekleri saklayabilirsiniz. </li></ol> Not: Bir doku örneği DNA genotipleme için herhangi bir aşamasında alınabilir, ancak, o kadar bu adımı tüm numunelerin toplu işlenmiş olabilir bu yüzden sadece depolama önce bir örnek almak için en uygun olabilir. Her embriyodan kuyruk, bacak veya kafa doku örneği toplayın ve ayrı tüpler içine tüm koymak. Doku örneği rehidrate ve genoty hazırlamakping. 2. ES Kültürleri Farklılaşan arasında LysoTracker Boyama <ol><li> 20 ul damla başına 500 hücre, bir başlangıç ​​yoğunluğunda Asılı damla yönteminde, 15 aracılığı ile embriyoid organları hazırlayın. </li><li> 3 gün sonra, 10 cm yapışmaz Petri kapları (bakteriyolojik çalışma için kullanılan bu yani) üzerine süspansiyon kültürü embriyoid organları aktarın. Medya her 2 günde değişen 5 gün, Kültür. </li><li> Günde 7 günü, jelatinize 8-iyi kamara slaytlara embriyoid organları aktarmak (odalarına Jelatin% 0.1 ekleyin, 5 dakika beklemek kaldırmak ve medya ekleyin). Kamara başına 1-2 embriyoid organları aktarın. </li><li> Her geçen gün medyanın değişen 10 gün, Kültür. Embriyoid vücut cam yüzeyine takılarak karıştırmayı vermeyecek şekilde odasına slayt köşesinde pipet yerleştirmek için dikkatli olun. Ayrıca taze medya da odanın köşesinde pipet yerleştirin ve ortamı yavaşça serbest eklerken. </li><li> Kült 10 gün sonraure, bir pozitif kontrol olarak apoptozu indüklemek için, 0.1 mM, 1.0 mM ve H2O 2 ile kuyu bazı tedavi etmek için 60 dakika (taze ortam karışımı H2O 2 ekleyin, daha sonra hücrelere ilave ediniz). D-PBS ve düzenli medya gecede kültürü ile iki kez durulayın. </li><li> Yavaşça mevcut medya aspire ve LysoTracker Hücre boyama çözeltisi (ortam içinde 500 nM LysoTracker (nihai konsantrasyon), bölme başına 300 ul) ilave edilir. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> D-PBS 2 kere, 5 dakika her biri ile iki kere yıkayın. </li><li> RT 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehid Fix. </li><li> D-PBS, 5 dakika ile iki kere yıkayın. </li></ol> 3. LysoTracker Vitray Embriyolar veya ES Kültürleri görüntüleniyor <ol><li> D-PBS aspire tarafından mikroskopi için hücre örnekleri hazırlayın; slaydın dışına odasına kaldırarak; hava yaklaşık 5 dakika kurutma; sonra sulu bir montaj orta (DAPI veya benzeri Vectashield) ekleyerek. Kurutma dola sırasında folyo bariyer yerleştiring fluorofor ağartma azaltmak için. Vectashield veya benzer bir derin depresyon cam tabak veya küçük Petri kabındaki embriyolar monte edin. </li><li> Bir rodamin veya Texas Red filtresi ile donatılmış bir diseksiyon veya bileşik mikroskop ile Visualize (LysoTracker KIRMIZI DND-99, Uyarma / Emisyon: 577/590 nm). Boyanma genellikle oldukça parlak yani uzun pozlama genellikle gerekli değildir. </li></ol> 4. Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Sonuçlar kantifikasyonu <ol><li> Manuel modda aynı pozlama koşulları altında örneklerin dijital fotoğraflar çekin. </li><li> Adobe Photoshop veya benzeri görüntüleme programı görüntüleri açın. LysoTracker boyanma miktarını belirlemek için, kırmızı kanal ve eşik kırmızı leke şimdi beyaz pikseller ile temsil olduğu gibi görüntü (siyah-beyaz görüntü dönüştürür) seçin. Beyaz pikseller seçin ve toplam sayıyı elde etmek için histogramı işlevini kullanın. </li><li> Saymak mavi kanal kullanınalanına çekirdeklerin sayısı. Bu görüntü açıklamalar ekleyerek sayısı kaydını tutmak için yararlı olabilir. </li><li> Değerleri kaydedin ve sonra hücre başına ortalama boyanma düzeyini hesaplamak. Eğer örnek isteyen tüm görüntüler için aynı eşik ayarı ile bu analizi tekrarlayın. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bu tür Sonic hedgehog (Shh) gibi bir büyüme faktörü geni, 16,17 çıkartıldığı zaman değişebilir embriyonik gelişimi sırasında PCD normal bir model vardır. LysoTracker derece difüze olan küçük bir moleküldür boya olduğundan, bütün embriyo mezenşimi 12,13 içinde bile derin PCD alanları değerlendirmek için görüntülenebilmektedir Şekil 1 normal ve Şşş için LysoTracker boyanma paterni gösterir -. Azından mutant fare embriyolarına - / 10.5dpc. Özellikle bacak ve somite regio olarak, mutasyona uğramış embriyoların - / - Bu aşamada, PCD Shh büyük ölçüde artmıştırns. Embriyo kısımları genel dağılımını değerlendirmek için yüksek büyütme (1B) de tüm montaj içinde görüntülenebilir. Dissected bölümleri de titreşimli mikrotom (1C) veya daha ayrıntılı PCD bölgeleri ortaya çıkarmak için bir kriyostat (DF) ile kesitli olabilir. Transferaz terminali penetrasyonu daha az sorunlu olduğu TUNEL analizi en iyi ince kesitler üzerinde yapılır. LysoTracker boyama ve bir TUNEL yöntemi ile aynı doku (Şekil 1B-G) de yapılabilir. Bu sonuçlar gösteriyor ki LysoTracker ve TUNEL boyama, oldukça PCD örtüşme genel bölgeler arasında sıkı bir korelasyon 01:01 olmamasına rağmen. Daha yüksek bir büyütmede, bu punktumlarda görmek mümkün olduğunu TUNEL yöntemi ile pozitif leke ancak LysoTracker LysoTracker boya ile sadece leke boya ki, punktumlarda, ve punktumlarda boyama ile üst üste gelmiş. Bir EB bir jelatin kaplı yüzey üzerine ekildi olduğunda, ayırt edici hücreler migrat olacaktıre dışarıya. Kültür 10 gün sonra, hücreler nöronlar, kas hücreleri, ve kardiyomiyositlerde de dahil olmak üzere hücre tiplerinde ayrışmıştır olacaktır. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi kültürler bu hücre tiplerinin karışık popülasyonları içerir, ancak bir ilgi çekici bir belirli hücre tipi PCD incelemek için protokol adapte olabilir. Örneğin, EB nöronların 19 farklılaşmasını arttırmak için retinoik asit ile tedavi edilebilir, ve daha sonra LysoTracker tahlil farklı koşullar altında nöronal hücre ölümünü değerlendirmek için kullanılabilir. ES farklılaşmış hücrelerin normal kültür olarak, LysoTracker ve / veya TUNEL analizi (Şekil 2A) ile PCD tabi tutulurlar ve bu tespit edilebilir bir kaç hücre vardır. PCD oksidatif hasara neden olur ve apoptotik yolu 20,21 başlatır örneğin hidrojen peroksit gibi farklı sitotoksik ajanların bir dizi (H2O 2) ile indüklenebilir. H 2 O 2 A düşük doz hem artırırLysoTracker ve TUNEL boyama, hiçbir tedavi ile karşılaştırıldığında hücre büzüşmesi ve yaygın LysoTracker ve TUNEL pozitifliği yüksek doz sonuç ederken. Embriyo sonuçlarına benzer şekilde, punktumlarda görmek mümkün olduğunu TUNEL yöntemi ile pozitif leke değil LysoTracker LysoTracker boya ile sadece leke o boya, punktumlarda ve punktumlarda boyama örtüşen bununla. Apopotosis neden olan sitotoksik bir ajan uygulanması sonucu otofaji (Şekil 2B) indüklemek açlık serum koşullar ile karşılaştırılır. Serum açlık (1 saat) bir süre geçirmiş Hücreler LysoTracker ve TUNEL boyama yüksek korelasyon farklı bir model sergiler. LysoTracker boyama çok işlenmemiş kültürler karşılaştırıldığında artmış, ancak TUNEL pozitifliği normal seviyelerde olduğunu. Adobe Photoshop mevcut standart araçları kullanma, LysoTracker boyama basit bir eşikleme yöntemi ile ölçülebilirbu bir hücre popülasyonunun için ortalama leke seviyesini hesaplamak için izin verir. Şekil 3A-B, bir numune görüntü ölçümü sırasında görünümünü göstermektedir. Mavi kanal (panel 3A) kırmızı kanal ve DAPI lekeli çekirdeklerinde LysoTracker boyama ile temel görüntü ile başlayarak, bu görüntünün kırmızı kanal siyah-beyaz görüntü dönüştürmek ve beyaz pikseller vardı için eşiklenir edildi sonra seçilen ve (Şekil 3A &#39;) sayıldı. Bir eşik seviyesi LysoTracker boyanması temsil ettiği seçilmiştir. Görüntüleri kullanan herhangi bir nicel yöntem olduğu gibi, potansiyel olarak aşırı vurgu farklılıkları neden olabilir bu gibi resimleri ışığa maruz kalmaması için önemlidir. Alanında çekirdeklerin sayısı sonra sadece mavi kanal (Şekil 3B) bakarak ve (Şekil 3B &#39;) sayma yaparken böyle bir fırça gibi bir çizim aracını kullanarak çekirdeklerin işaretleyerek sayılabilir. Bir sonra inci ifade edebilirhücre başına boyama ortalama seviyesi hesaplayarak boyanma e seviye (piksel / çekirdeklerin sayısı sayısı). Bir dilek yüksek yoluyla-put taraması için bu algoritmayı kullanmak için, en tarama paketleri belirli bir kanalın parlaklık ölçmek ve aynı zamanda en tipik uygulamalar için manuel yöntem hızlıdır ancak, bir alandaki çekirdekleri sayabilir ve olacağı bir nesne tanımlayıcı işlevi olabilir basit. Bir örnek vermek gerekirse, Şekil 2A-C örnek bir bölge ölçülmesi ve sonuçların teyit ettiği LysoTracker boyanma düzeyi yüksek (Şekil 3C) H 2 O 2 sonuç konsantrasyonu artmaktadır. Edildi <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. / - - Embriyo normal ve Şşş yılında LysoTracker boyama. A, A &#39;Normal ve Sus -. / - LysoTracker Kırmızı ile boyanan 10.5 DPC, az fare embriyolarına Vectashield monte ve altında fotoğraflandıBir epiflourescence mikroskop diseksiyon. Konsollar ayakları yerini gösterecektir B, B &#39;normal ve Şşş ve yüzgeç -.. / - Embriyoların yüksek büyütmede görüntülenmiş. &#39;Arka Nekrotik Dilimi&#39; (yıldız ile işaretli) ve ekstremite tomurcuğu (bir ok ile işaretli) proksimal mezenşimi bir bölge de dahil olmak üzere hücre ölümü normal bir etki unutmayın. Şşş boş bacaklarda medial ve distal bölümünde kuvvetli boyanma gösteren Normal ve null hem ekstremite tomurcukları ön ayakları tomurcuk aracılığıyla. C, C &#39;. Medial bölümleri. Boş ekstremite tomurcuğu içinde normal ekstremite tomurcuğu ve dorsal ve ventral ve distal mezenşimi içinde güçlü boyama proksimal mezenşimi (ok) ve AER (ok başı) olarak boyanma varlığı unutmayın. DF. Aynı bölümde (12 mikron, dondurulmuş bölümü) LysoTracker ve TUNEL boyama (Roche 1684795) için görüntülendi. Bölüm Shh boş mesenc distal kısmına geçerhyme. AER ok ucu noktaları. Genel görünüm, her iki yöntem kullanılarak çok benzer ne kadar Bununla birlikte boyama tam olarak üst üste gelmez. G, G &#39;. AER ve mezenşim daha yüksek bir büyütmede, bir ya da LysoTracker TUNEL-pozitif olan punktumlarda varlığı hem de görebilir Sadece yanı punktumlarda sıra boyama örtüşen olduğunu. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Farklılaşmış ES hücreleri içinde LysoTracker boyama. Hücre ayırımı yapmak LIF yokluğunda oda 8-slaytlar üzerine ekildi. Otofaji yolun serum açlık 1 saat ile oluşturuldu ise LysoTracker ve TUNEL boyama karşılaştırmak nasıl göstermek için, apoptoz yolu, H 2 O 2 2 farklı dozda oluşturuldu. Bu görüntüler bir Zeiss YTM 5 Konfokal Mikroskop ile alınmıştır A-A&#39;&#39;:. LysoT tarafından belirtildiği gibi İşlenmemiş kültürlerin bazı normal apoptozisi göstermekRacker ve TUNEL boyama. Çoğunlukla iki teknikler örtüşmektedir (beyaz oklar) kullanarak desen, ancak, bir LysoTracker sadece pozitif (kırmızı oklar) bir kaç punktumlarda görebilirsiniz B-B&#39;&#39;, CC &quot;:. H 2 artan miktarlarda tedavisi O 2 apoptozisi uyarır . düşük dozda daha LysoTracker ve Nokodazol göre TUNEL pozitif punktumlarda gösterir. yüksek dozda daha LysoTracker ve TUNEL pozitif punktumlarda yol açmaktadır. Beyaz oklar çakışan boyama, sadece LysoTracker için olumlu olduğunu punktumlarda kırmızı oklar ise. Bu TUNEL boyama (yeşil oklar) için pozitif olan punktumlarda görmek mümkündür DD &quot;:. açlık serum lizozomlar ve autophagolysosomes malzemenin bir birikiminin teşvik edebilir ki, otofaji neden olabilir. Işlenmemiş kültürler karşılaştırıldığında görülebilir daha kaç LysoTracker punktumlarda unutmayın. TUNEL pozitif punktumlarda mevcut (çoğu LysoTracker leke örtüşening, beyaz oklar), ancak, sayı işlenmemiş şartlara göre büyük ölçüde artmış değildir. Buna ek olarak, açlık serum koşullar altında, LysoTracker yalnızca pozitif punktumlarda oldukça yaygındır (kırmızı oklar). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3,. Adobe Photoshop kullanarak hücre popülasyonunda boyama düzeyini değerlendirmek için Sayısallaştırma yöntemi. A: Şekil 2A bir kısmı seçildi ve LysoTracker (kırmızı kanal) ve DAPI boyama (çekirdekler, mavi kanal) Bu panelde gösterilir A &#39;:. Şekil 3A kırmızı kanal siyah-ve dönüştürmek için eşiklenir edildi image-beyaz. Beyaz pikseller seçilir ve histogram fonksiyonu kullanılarak sayabiliriz B-B &#39;:. Kanal mavi çekirdekler gösterir ve onları sayma yaparken, görüntü gibi bir fırça gibi bir çizim işlevi ile açıklamalı olabilir C:. Bu expaneller 2A-C örnek bol miktar. Veri çekirdeği başına piksel olarak temsil edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Baehrecke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+death+shapes+life+during+development.">How death shapes life during development.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).</li><li>Meier, P., Finch, A., Evan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+development.">Apoptosis in development.</a> Nature. 407, 796-801 (2000).</li><li>Ikonomidou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+apoptotic+neurodegeneration+and+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome.</a> Science. 287, 1056-1060 (2000).</li><li>Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+embryonic+cell+populations+to+ethanol-induced+apoptosis:+implications+for+alcohol-related+birth+defects+and+neurodevelopmental+disorder.">Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).</li><li>Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+of+5-FU-treated+fetal+rat+limbs+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+Lysotracker.">Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker.</a> Cytometry A. 53, 9-21 (2003).</li><li>Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development.">Programmed cell death in animal development.</a> Cell. 88, 347-354 (1997).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147, 742-758 (2011).</li><li>Qu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+gene-dependent+clearance+of+apoptotic+cells+during+embryonic+development.">Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development.</a> Cell. 128, 931-946 (2007).</li><li>Grimsley, C., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cues+for+apoptotic+cell+engulfment:+eat-me,+don't+eat-me+and+come-get-me+signals.">Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals.</a> Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Cytometry. 33, 348-354 (1998).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+morphology+in+mouse+embryos+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy.</a> Methods. 18, 473-480 (1999).</li><li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation.">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Chiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+the+limb+prepattern:+limb+development+in+the+absence+of+sonic+hedgehog+function.">Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function.</a> Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).</li><li>Ishibashi, M., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sonic+hedgehog-dependent+signaling+relay+regulates+growth+of+diencephalic+and+mesencephalic+primordia+in+the+early+mouse+embryo.">A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo.</a> Development. 129, 4807-4819 (2002).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Dumont, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+is+CD95-independent,+requires+the+release+of+mitochondria-derived+reactive+oxygen+species+and+the+activation+of+NF-kappaB.">Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB.</a> Oncogene. 18, 747-757 (1999).</li><li>Hampton, M. B., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+caspase+activity+by+hydrogen+peroxide:+implications+for+apoptosis.">Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis.</a> FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).</li><li>Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+engulf+and+clear+apoptotic+footplate+cells+in+macrophageless+PU.1+null+mouse+embryos.">Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos.</a> Development. 127, 5245-5252 (2000).</li><li>Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+autophagy+by+Atg1+inhibits+cell+growth+and+induces+apoptotic+cell+death.">Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death.</a> Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracker+dyes+to+probe+mitochondrial+autophagy+(mitophagy)+in+rat+hepatocytes.">Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes.</a> Autophagy. 2, 39-46 (2006).</li><li>Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+autophagy+visualized+in+live+cells:+from+autophagosome+formation+to+fusion+with+endo/lysosomes.">The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes.</a> Autophagy. 1, 23-36 (2005).</li><li>Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+autophagy+is+related+to+programmed+cell+death+during+the+development+of+the+nervous+system.">How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Apoptoz Önemli diğerlerinden ayıran kaspaz aktivitesinin tespiti ile birlikte TUNEL yöntemi ile DNA hasar tespiti, (mAb veya ZVAD-FMK olarak bağlayıcı bir molekül ile algılanır), hücresel değişikliklerin gözlenmesi ve fosfatidilserin sunumu (PS dahil membran yüzeyinde) (Annexin V bağlama tarafından algılanır). Bu testlerin her biri ile bazı dezavantajları vardır. Örneğin, TUNEL yöntemi içinde kullanılan terminal transferaz birkaç hücre tabakası ötesine nüfuz etmez. Ayrıca Annexin V gibi ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td></td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> LysoTracker Kırmızı DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VEKTÖR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> Cellgro </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Cellgro </td><td> 25-000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Kalem-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-merkaptoetanol, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> LABTEK-II Odası slaytlar (8-de) </td><td> Nalge Nunc Uluslararası </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.1 jelatin </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözüm Tarifler 4% Paraformaldehyde 100 ml için: <ol><li> 4 g paraformaldehit, 90 ml H2O, ve NaOH (2N NaOH, bir damla) karıştırılır. Eğer pH artırmak için bazı NaOH kadar paraformaldehid çözüm girmeyeceğim. </li><li> 60 karıştırın ve ısı ° C Tüm toz çözüm (~ 10-20 dakika) kadar. Isıtmayın. </li><li> 100 ml&#39;lik bir nihai hacim elde etmek için ~ 10 ml PBS 10x ekleyin. </li><li> Uygun (~ 10 mi veya ~ 40 mi) alikots içinde -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Uyarı: &#39;fırfır&#39; şeklinde (ufak topaklar sıkıştırılmış) içinde paraformaldehit daha az toz halinde olan ve bu nedenle de bir başlık dışında ölçülebilir. Ancak yine de bir koruyucu toz maskesi (N95 giymeliEn az) kullanım sırasında. EB Kültür Medya 500 ml EB Medya için: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404.5 ml&#39;lik </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75.0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol: </td><td> 500ul </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

Programlanmış hücre ölümü (PCD) normal doku homeostazı muhafaza etmek ve embriyolojik gelişimi sırasında doku ve organların 1,2,6,7 şekillendirmeye yetişkinlerde görülür. Gelişimi sırasında, toksik kimyasallar ve genetik değişiklikler PCD bir artışa neden olabilir veya gelişimsel anomalileri ve doğum kusurlarına 3-5 sonuçlanan PCD kalıplarını değiştirebilirsiniz. Bu defektlerin etyolojisi anlamak için, embriyo çalışmada embriyonik kök (ES) hücreler ayırt kullanabilirsiniz in vitro tayinlerde ile tamamlanabilir. Apoptoz kaspaz enzim kaskad etkinleştirmek için sinyal içsel ve dışsal hem de içerir PCD iyi çalışılmış şeklidir. Karakteristik hücre değişiklikleri zarı blebbing, nükleer daralma ve DNA fragmantasyonu içerir. PCD diğer formları kaspaz aktivasyonunun içermeyen ve uzun otofaji ve nihai sonucu olabilir. Ne olursa olsun PCD yolunun, ölen hücrelerin çıkarılması gerekir. Erişkinlerde, bağışıklık hücrelerinin perfembriyolarda, bağışıklık sistemi henüz oluşmamış, nerede kaldırma alternatif bir mekanizma ile oluşur ise, bu fonksiyonu yapýnýz. Bu mekanizma alarak komşu hücreleri (&quot;non-profesyonel fagositler&quot; denir) içeren bir fagositik rol onlar ölüyor hücre ve yutmak 8-10 yüzeyinde sinyal &#39;ye beni&#39; tanır. Yutulma sonra, kalıntı bozulması için lizozom getirilir. Böylece bağımsız PCD mekanizması, lizozomal aktivite artışı artan hücre ölümü ile ilişkili olabilir. PCD, kalın dokular ve çok katmanlı ayırt kültürlerde lizozomlar görselleştirmek için basit bir tahlil incelemek yararlı olabilir. LysoTracker bu tür boya lizozom 11-13 gibi asidik hücre içi bölmeler içinde tutulan bir yüksek derecede çözünür küçük bir moleküldür. Boya difüzyon ile ve dolaşım yoluyla alınır. Penetrasyon kalın dokular ve çok katmanlı kültürlerinde PCD bir engel, görselleştirme olmadığı 12,13 mümkündür </&gt; sup. Işlem, bir terminalin giriş / geçirgenlik transferaz gerektirir çünkü aksine, TUNEL (Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme) analizi, 14, küçük örnekler, histolojik bölümler ve tek tabakalı kültürler ile sınırlıdır. Yayılır ve çözücüler tarafından çözülür Anilin mavisi, aksine, LysoTracker Kırmızı DND-99 düzeltilebilir, parlak, ve kararlı. Boyama bütün montaj veya sulu veya çözücü bazlı montaj medya 12,13 kullanarak bölümünde standart floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntülenebilmektedir. Burada normal ve sonik kirpi boş fare embriyolarının PCD bakmak için bu boya kullanılarak protokolleri tanımlar. Buna ek olarak, ES hücre kültürlerinde ayırt PSD analizi gösteren basit bir miktar yöntem sunuyoruz. Özet olarak, LysoTracker boyama PCD saptanmasında diğer yöntemler için büyük bir tamamlayıcı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

use-lysotracker-to-detect-programmed-cell-death-embryos

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

23.1K Görüntüleme.  University of Southern California. Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Video: Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Gelişim Biyolojisi

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

Optik Görüntüleme ile non-invaziv Algılama için Floresan Boyalar Kök Hücreler Etiketleme

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biyoloji

In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative medicine. However, direct injection of hESCs, and cells differentiated from hESCs, into living organisms has thus far been hampered by significant cell death, teratoma formation, and host immune rejection. Understanding the in vivo hESC behavior after transplantation requires novel imaging techniques to longitudinally monitor hESC localization, proliferation, and viability. Molecular imaging has given investigators a high-throughput, inexpensive, and sensitive means for tracking in vivo cell proliferation over days, weeks, and even months. This advancement has significantly increased the understanding of the spatio-temporal kinetics of hESC engraftment, proliferation, and teratoma-formation in living subjects.

A major advance in molecular imaging has been the extension of noninvasive reporter gene assays from molecular and cellular biology into in vivo multi-modality imaging platforms. These reporter genes, under control of engineered promoters and enhancers that take advantage of the host cell s transcriptional machinery, are introduced into cells using a variety of vector and non-vector methods. Once in the cell, reporter genes can be transcribed either constitutively or only under specific biological or cellular conditions, depending on the type of promoter used. Transcription and translation of reporter genes into bioactive proteins is then detected with sensitive, noninvasive instrumentation (e.g., CCD cameras) using signal-generating probes such as D-luciferin.

To avoid the need for excitatory light to track stem cells in vivo as is required for fluorescence imaging, bioluminescence reporter gene imaging systems require only an exogenously administered probe to induce light emission. Firefly luciferase, derived from the firefly Photinus pyralis, encodes an enzyme that catalyzes D-luciferin to the optically active metabolite, oxyluciferin. Optical activity can then be monitored with an external CCD camera. Stably transduced cells that carry the reporter construct within their chromosomal DNA will pass the reporter construct DNA to daughter cells, allowing for longitudinal monitoring of hESC survival and proliferation in vivo. Furthermore, because expression of the reporter gene product is required for signal generation, only viable parent and daughter cells will create bioluminescence signal; apoptotic or dead cells will not. 

In this video, the specific materials and methods needed for tracking stem cell proliferation and teratoma formation with bioluminescence imaging will be described.

With the growing interest in stem cell therapies, molecular imaging techniques are ideal for monitoring stem cell behavior after transplantation. Luciferase reporter genes have enabled non-invasive, repetitive assessment of cell survival, location, and proliferation in vivo. This video will demonstrate how to track hESC proliferation in a living mouse.

In vitro ve in vivo Biyoparlaklık Reporter Gen Görüntüleme İnsan Embriyonik Kök Hücreleri

The discovery of human embryonic stem cells (hESCs) has dramatically increased the tools available to medical scientists interested in regenerative ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

Akım Sitometresi ile Fare Embriyosunda Eritromiyeloid Progenitörlerin Ve Döllerinin Belirlenmesi

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. The classical histochemical reaction is based on the hydrolysis of the substrate X-gal in combination with ferric and ferrous ions, which produces an insoluble blue precipitate that is easy to visualize. Therefore, &#946;-galactosidase activity serves as a marker for the expression pattern of the gene of interest as the development proceeds. Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the subsequent method for paraffin sectioning and counterstaining. Additionally, a procedure for clarifying whole embryos is provided to better visualize X-gal staining in deeper regions of the embryo. Consistent results are obtained by performing this procedure, although optimization of reaction conditions is needed to minimize background activity. Limitations in the assay should be also considered, particularly regarding the size of the embryo in whole mount staining. Our protocol provides a sensitive and a reliable method for &#946;-galactosidase detection during the mouse development that can be further applied to the cryostat sections as well as whole organs. Thus, the dynamic gene expression patterns throughout development can be easily analyzed by using this protocol in whole embryos, but also detailed expression at the cellular level can be assessed after paraffin sectioning.

Here we describe the standard protocol for the detection of &#946;-galactosidase activity in early whole mouse embryos and the method for paraffin sectioning and counterstaining. This is an easy and quick procedure to monitor gene expression during development that can also be applied to tissue sections, organs or cultured cells.

Tüm fare embriyo etkinliğinde β-galaktozidaz tespiti yoluyla Gen ifadesinin izleme

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Nörobilim

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Gelişmekte Olan (Kurbağa) Embriyoda Hücre-Soy Kılavuzlu Kütle Spektrometrisi Proteomikleri

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

Kimya

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Erken Embriyo Oluşumu Zaman atlamalı Mikroskopi Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Embriyonik Fare Kalpler Gelişmekte Hücre Etiketleme ve Enjeksiyon

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...