Biz protokol düzenleme yardım Mariani laboratuar üyeleri ederim. Bu çalışma CIRM Doktoraüstü Eğitim Grant (JLF), bir CIRM KÖPRÜLER staj (TZTT), Robert E. ve Mayıs R. Wright Vakfı (FVM) ve Güney Kaliforniya Üniversitesi (FVM) tarafından finanse edildi.

1. Fare Embryolarının LysoTracker Boyama <ol><li> Erkek damızlık kafesi içine genç (5-6 haftalık) kadın koyarak fare embriyoları oluşturun. Bu çiftleşme gösteren bir vajinal fiş görünümü için aşağıdaki sabahları Monitör oluştu. Kadın hamile ise, o gün öğlen 0.5 DPC (gün sonrası çiftleşme) denir. Burada sunulan prosedür embriyolar 7-13 DPC için idealdir. </li><li> Ilgi embriyonik gününde, onaylı protokollere göre kadın ötenazi ve rahim kaldırmak. Hanks BSS (fenol kırmızısı olmadan) ile 10 santimetrelik bir petri tabağına desidua dan embriyolar çıkarın. Ekstra embriyonik membranlar çıkarın ve en az bir gereksiz doku ve kan kaldırmak Hanks BSS ile yıkayın yok. </li><li> LysoTracker Embriyo Boyama Çözüm (Hanks BSS 5 mM LysoTracker) hazırlayın. 1-2 litre için uygun bir hacmi 5 ml &#39;dir. Yavaşça eşit boya dağıtacak karıştırın. </li><li> LysoTracker Embriyo Boyama Solut embriyo ekle45 dakika için bir mikrofüj tüpü ya da 37 ° C &#39;de ve flakon inkübe iyon. </li><li> Hanks BSS çok yavaşça dört kez, 5 dakika, her yıkama yıkayın. </li><li> Gecede 4% Paraformaldehyde düzelt. </li><li> Düzeltmesini kaldırmak için, Hanks BSS, 10 dakika içinde bir kez yıkayın. </li><li> Arka plan boyama ortadan kaldırmak için bir metanol serisi (% 50,% 75,% 80,% 100, 5 dk her adımda) aracılığıyla kurutmak. Bu görüntüleme sırasında iyi sinyal-gürültü elde etmek için önemlidir. </li><li> Bu noktada ışıktan koruyarak, -20 ° C&#39;de metanol içinde süresiz embriyo örnekleri saklayabilirsiniz. </li></ol> Not: Bir doku örneği DNA genotipleme için herhangi bir aşamasında alınabilir, ancak, o kadar bu adımı tüm numunelerin toplu işlenmiş olabilir bu yüzden sadece depolama önce bir örnek almak için en uygun olabilir. Her embriyodan kuyruk, bacak veya kafa doku örneği toplayın ve ayrı tüpler içine tüm koymak. Doku örneği rehidrate ve genoty hazırlamakping. 2. ES Kültürleri Farklılaşan arasında LysoTracker Boyama <ol><li> 20 ul damla başına 500 hücre, bir başlangıç ​​yoğunluğunda Asılı damla yönteminde, 15 aracılığı ile embriyoid organları hazırlayın. </li><li> 3 gün sonra, 10 cm yapışmaz Petri kapları (bakteriyolojik çalışma için kullanılan bu yani) üzerine süspansiyon kültürü embriyoid organları aktarın. Medya her 2 günde değişen 5 gün, Kültür. </li><li> Günde 7 günü, jelatinize 8-iyi kamara slaytlara embriyoid organları aktarmak (odalarına Jelatin% 0.1 ekleyin, 5 dakika beklemek kaldırmak ve medya ekleyin). Kamara başına 1-2 embriyoid organları aktarın. </li><li> Her geçen gün medyanın değişen 10 gün, Kültür. Embriyoid vücut cam yüzeyine takılarak karıştırmayı vermeyecek şekilde odasına slayt köşesinde pipet yerleştirmek için dikkatli olun. Ayrıca taze medya da odanın köşesinde pipet yerleştirin ve ortamı yavaşça serbest eklerken. </li><li> Kült 10 gün sonraure, bir pozitif kontrol olarak apoptozu indüklemek için, 0.1 mM, 1.0 mM ve H2O 2 ile kuyu bazı tedavi etmek için 60 dakika (taze ortam karışımı H2O 2 ekleyin, daha sonra hücrelere ilave ediniz). D-PBS ve düzenli medya gecede kültürü ile iki kez durulayın. </li><li> Yavaşça mevcut medya aspire ve LysoTracker Hücre boyama çözeltisi (ortam içinde 500 nM LysoTracker (nihai konsantrasyon), bölme başına 300 ul) ilave edilir. </li><li> 15 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> D-PBS 2 kere, 5 dakika her biri ile iki kere yıkayın. </li><li> RT 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehid Fix. </li><li> D-PBS, 5 dakika ile iki kere yıkayın. </li></ol> 3. LysoTracker Vitray Embriyolar veya ES Kültürleri görüntüleniyor <ol><li> D-PBS aspire tarafından mikroskopi için hücre örnekleri hazırlayın; slaydın dışına odasına kaldırarak; hava yaklaşık 5 dakika kurutma; sonra sulu bir montaj orta (DAPI veya benzeri Vectashield) ekleyerek. Kurutma dola sırasında folyo bariyer yerleştiring fluorofor ağartma azaltmak için. Vectashield veya benzer bir derin depresyon cam tabak veya küçük Petri kabındaki embriyolar monte edin. </li><li> Bir rodamin veya Texas Red filtresi ile donatılmış bir diseksiyon veya bileşik mikroskop ile Visualize (LysoTracker KIRMIZI DND-99, Uyarma / Emisyon: 577/590 nm). Boyanma genellikle oldukça parlak yani uzun pozlama genellikle gerekli değildir. </li></ol> 4. Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Sonuçlar kantifikasyonu <ol><li> Manuel modda aynı pozlama koşulları altında örneklerin dijital fotoğraflar çekin. </li><li> Adobe Photoshop veya benzeri görüntüleme programı görüntüleri açın. LysoTracker boyanma miktarını belirlemek için, kırmızı kanal ve eşik kırmızı leke şimdi beyaz pikseller ile temsil olduğu gibi görüntü (siyah-beyaz görüntü dönüştürür) seçin. Beyaz pikseller seçin ve toplam sayıyı elde etmek için histogramı işlevini kullanın. </li><li> Saymak mavi kanal kullanınalanına çekirdeklerin sayısı. Bu görüntü açıklamalar ekleyerek sayısı kaydını tutmak için yararlı olabilir. </li><li> Değerleri kaydedin ve sonra hücre başına ortalama boyanma düzeyini hesaplamak. Eğer örnek isteyen tüm görüntüler için aynı eşik ayarı ile bu analizi tekrarlayın. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Bu tür Sonic hedgehog (Shh) gibi bir büyüme faktörü geni, 16,17 çıkartıldığı zaman değişebilir embriyonik gelişimi sırasında PCD normal bir model vardır. LysoTracker derece difüze olan küçük bir moleküldür boya olduğundan, bütün embriyo mezenşimi 12,13 içinde bile derin PCD alanları değerlendirmek için görüntülenebilmektedir Şekil 1 normal ve Şşş için LysoTracker boyanma paterni gösterir -. Azından mutant fare embriyolarına - / 10.5dpc. Özellikle bacak ve somite regio olarak, mutasyona uğramış embriyoların - / - Bu aşamada, PCD Shh büyük ölçüde artmıştırns. Embriyo kısımları genel dağılımını değerlendirmek için yüksek büyütme (1B) de tüm montaj içinde görüntülenebilir. Dissected bölümleri de titreşimli mikrotom (1C) veya daha ayrıntılı PCD bölgeleri ortaya çıkarmak için bir kriyostat (DF) ile kesitli olabilir. Transferaz terminali penetrasyonu daha az sorunlu olduğu TUNEL analizi en iyi ince kesitler üzerinde yapılır. LysoTracker boyama ve bir TUNEL yöntemi ile aynı doku (Şekil 1B-G) de yapılabilir. Bu sonuçlar gösteriyor ki LysoTracker ve TUNEL boyama, oldukça PCD örtüşme genel bölgeler arasında sıkı bir korelasyon 01:01 olmamasına rağmen. Daha yüksek bir büyütmede, bu punktumlarda görmek mümkün olduğunu TUNEL yöntemi ile pozitif leke ancak LysoTracker LysoTracker boya ile sadece leke boya ki, punktumlarda, ve punktumlarda boyama ile üst üste gelmiş. Bir EB bir jelatin kaplı yüzey üzerine ekildi olduğunda, ayırt edici hücreler migrat olacaktıre dışarıya. Kültür 10 gün sonra, hücreler nöronlar, kas hücreleri, ve kardiyomiyositlerde de dahil olmak üzere hücre tiplerinde ayrışmıştır olacaktır. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi kültürler bu hücre tiplerinin karışık popülasyonları içerir, ancak bir ilgi çekici bir belirli hücre tipi PCD incelemek için protokol adapte olabilir. Örneğin, EB nöronların 19 farklılaşmasını arttırmak için retinoik asit ile tedavi edilebilir, ve daha sonra LysoTracker tahlil farklı koşullar altında nöronal hücre ölümünü değerlendirmek için kullanılabilir. ES farklılaşmış hücrelerin normal kültür olarak, LysoTracker ve / veya TUNEL analizi (Şekil 2A) ile PCD tabi tutulurlar ve bu tespit edilebilir bir kaç hücre vardır. PCD oksidatif hasara neden olur ve apoptotik yolu 20,21 başlatır örneğin hidrojen peroksit gibi farklı sitotoksik ajanların bir dizi (H2O 2) ile indüklenebilir. H 2 O 2 A düşük doz hem artırırLysoTracker ve TUNEL boyama, hiçbir tedavi ile karşılaştırıldığında hücre büzüşmesi ve yaygın LysoTracker ve TUNEL pozitifliği yüksek doz sonuç ederken. Embriyo sonuçlarına benzer şekilde, punktumlarda görmek mümkün olduğunu TUNEL yöntemi ile pozitif leke değil LysoTracker LysoTracker boya ile sadece leke o boya, punktumlarda ve punktumlarda boyama örtüşen bununla. Apopotosis neden olan sitotoksik bir ajan uygulanması sonucu otofaji (Şekil 2B) indüklemek açlık serum koşullar ile karşılaştırılır. Serum açlık (1 saat) bir süre geçirmiş Hücreler LysoTracker ve TUNEL boyama yüksek korelasyon farklı bir model sergiler. LysoTracker boyama çok işlenmemiş kültürler karşılaştırıldığında artmış, ancak TUNEL pozitifliği normal seviyelerde olduğunu. Adobe Photoshop mevcut standart araçları kullanma, LysoTracker boyama basit bir eşikleme yöntemi ile ölçülebilirbu bir hücre popülasyonunun için ortalama leke seviyesini hesaplamak için izin verir. Şekil 3A-B, bir numune görüntü ölçümü sırasında görünümünü göstermektedir. Mavi kanal (panel 3A) kırmızı kanal ve DAPI lekeli çekirdeklerinde LysoTracker boyama ile temel görüntü ile başlayarak, bu görüntünün kırmızı kanal siyah-beyaz görüntü dönüştürmek ve beyaz pikseller vardı için eşiklenir edildi sonra seçilen ve (Şekil 3A &#39;) sayıldı. Bir eşik seviyesi LysoTracker boyanması temsil ettiği seçilmiştir. Görüntüleri kullanan herhangi bir nicel yöntem olduğu gibi, potansiyel olarak aşırı vurgu farklılıkları neden olabilir bu gibi resimleri ışığa maruz kalmaması için önemlidir. Alanında çekirdeklerin sayısı sonra sadece mavi kanal (Şekil 3B) bakarak ve (Şekil 3B &#39;) sayma yaparken böyle bir fırça gibi bir çizim aracını kullanarak çekirdeklerin işaretleyerek sayılabilir. Bir sonra inci ifade edebilirhücre başına boyama ortalama seviyesi hesaplayarak boyanma e seviye (piksel / çekirdeklerin sayısı sayısı). Bir dilek yüksek yoluyla-put taraması için bu algoritmayı kullanmak için, en tarama paketleri belirli bir kanalın parlaklık ölçmek ve aynı zamanda en tipik uygulamalar için manuel yöntem hızlıdır ancak, bir alandaki çekirdekleri sayabilir ve olacağı bir nesne tanımlayıcı işlevi olabilir basit. Bir örnek vermek gerekirse, Şekil 2A-C örnek bir bölge ölçülmesi ve sonuçların teyit ettiği LysoTracker boyanma düzeyi yüksek (Şekil 3C) H 2 O 2 sonuç konsantrasyonu artmaktadır. Edildi <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig1.jpg" alt="Şekil 1"/> Şekil 1. / - - Embriyo normal ve Şşş yılında LysoTracker boyama. A, A &#39;Normal ve Sus -. / - LysoTracker Kırmızı ile boyanan 10.5 DPC, az fare embriyolarına Vectashield monte ve altında fotoğraflandıBir epiflourescence mikroskop diseksiyon. Konsollar ayakları yerini gösterecektir B, B &#39;normal ve Şşş ve yüzgeç -.. / - Embriyoların yüksek büyütmede görüntülenmiş. &#39;Arka Nekrotik Dilimi&#39; (yıldız ile işaretli) ve ekstremite tomurcuğu (bir ok ile işaretli) proksimal mezenşimi bir bölge de dahil olmak üzere hücre ölümü normal bir etki unutmayın. Şşş boş bacaklarda medial ve distal bölümünde kuvvetli boyanma gösteren Normal ve null hem ekstremite tomurcukları ön ayakları tomurcuk aracılığıyla. C, C &#39;. Medial bölümleri. Boş ekstremite tomurcuğu içinde normal ekstremite tomurcuğu ve dorsal ve ventral ve distal mezenşimi içinde güçlü boyama proksimal mezenşimi (ok) ve AER (ok başı) olarak boyanma varlığı unutmayın. DF. Aynı bölümde (12 mikron, dondurulmuş bölümü) LysoTracker ve TUNEL boyama (Roche 1684795) için görüntülendi. Bölüm Shh boş mesenc distal kısmına geçerhyme. AER ok ucu noktaları. Genel görünüm, her iki yöntem kullanılarak çok benzer ne kadar Bununla birlikte boyama tam olarak üst üste gelmez. G, G &#39;. AER ve mezenşim daha yüksek bir büyütmede, bir ya da LysoTracker TUNEL-pozitif olan punktumlarda varlığı hem de görebilir Sadece yanı punktumlarda sıra boyama örtüşen olduğunu. <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig2.jpg" alt="Şekil 2,"/> Şekil 2. Farklılaşmış ES hücreleri içinde LysoTracker boyama. Hücre ayırımı yapmak LIF yokluğunda oda 8-slaytlar üzerine ekildi. Otofaji yolun serum açlık 1 saat ile oluşturuldu ise LysoTracker ve TUNEL boyama karşılaştırmak nasıl göstermek için, apoptoz yolu, H 2 O 2 2 farklı dozda oluşturuldu. Bu görüntüler bir Zeiss YTM 5 Konfokal Mikroskop ile alınmıştır A-A&#39;&#39;:. LysoT tarafından belirtildiği gibi İşlenmemiş kültürlerin bazı normal apoptozisi göstermekRacker ve TUNEL boyama. Çoğunlukla iki teknikler örtüşmektedir (beyaz oklar) kullanarak desen, ancak, bir LysoTracker sadece pozitif (kırmızı oklar) bir kaç punktumlarda görebilirsiniz B-B&#39;&#39;, CC &quot;:. H 2 artan miktarlarda tedavisi O 2 apoptozisi uyarır . düşük dozda daha LysoTracker ve Nokodazol göre TUNEL pozitif punktumlarda gösterir. yüksek dozda daha LysoTracker ve TUNEL pozitif punktumlarda yol açmaktadır. Beyaz oklar çakışan boyama, sadece LysoTracker için olumlu olduğunu punktumlarda kırmızı oklar ise. Bu TUNEL boyama (yeşil oklar) için pozitif olan punktumlarda görmek mümkündür DD &quot;:. açlık serum lizozomlar ve autophagolysosomes malzemenin bir birikiminin teşvik edebilir ki, otofaji neden olabilir. Işlenmemiş kültürler karşılaştırıldığında görülebilir daha kaç LysoTracker punktumlarda unutmayın. TUNEL pozitif punktumlarda mevcut (çoğu LysoTracker leke örtüşening, beyaz oklar), ancak, sayı işlenmemiş şartlara göre büyük ölçüde artmış değildir. Buna ek olarak, açlık serum koşullar altında, LysoTracker yalnızca pozitif punktumlarda oldukça yaygındır (kırmızı oklar). <img src="/files/ftp_upload/4254/4254fig3.jpg" alt="Şekil 3"/> Şekil 3,. Adobe Photoshop kullanarak hücre popülasyonunda boyama düzeyini değerlendirmek için Sayısallaştırma yöntemi. A: Şekil 2A bir kısmı seçildi ve LysoTracker (kırmızı kanal) ve DAPI boyama (çekirdekler, mavi kanal) Bu panelde gösterilir A &#39;:. Şekil 3A kırmızı kanal siyah-ve dönüştürmek için eşiklenir edildi image-beyaz. Beyaz pikseller seçilir ve histogram fonksiyonu kullanılarak sayabiliriz B-B &#39;:. Kanal mavi çekirdekler gösterir ve onları sayma yaparken, görüntü gibi bir fırça gibi bir çizim işlevi ile açıklamalı olabilir C:. Bu expaneller 2A-C örnek bol miktar. Veri çekirdeği başına piksel olarak temsil edilir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4254/4254fig3large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> .

<ol>
	<li>Baehrecke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+death+shapes+life+during+development.">How death shapes life during development.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3, 779-787 (2002).</li><li>Meier, P., Finch, A., Evan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+in+development.">Apoptosis in development.</a> Nature. 407, 796-801 (2000).</li><li>Ikonomidou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+apoptotic+neurodegeneration+and+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol-induced apoptotic neurodegeneration and fetal alcohol syndrome.</a> Science. 287, 1056-1060 (2000).</li><li>Dunty, W. C., Chen, S. Y., Zucker, R. M., Dehart, D. B., Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+embryonic+cell+populations+to+ethanol-induced+apoptosis:+implications+for+alcohol-related+birth+defects+and+neurodevelopmental+disorder.">Selective vulnerability of embryonic cell populations to ethanol-induced apoptosis: implications for alcohol-related birth defects and neurodevelopmental disorder.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 25, 1523-1535 (2001).</li><li>Price, O. T., Lau, C., Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+fluorescence+of+5-FU-treated+fetal+rat+limbs+using+confocal+laser+scanning+microscopy+and+Lysotracker.">Quantitative fluorescence of 5-FU-treated fetal rat limbs using confocal laser scanning microscopy and Lysotracker.</a> Cytometry A. 53, 9-21 (2003).</li><li>Jacobson, M. D., Weil, M., Raff, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development.">Programmed cell death in animal development.</a> Cell. 88, 347-354 (1997).</li><li>Fuchs, Y., Steller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+death+in+animal+development+and+disease.">Programmed cell death in animal development and disease.</a> Cell. 147, 742-758 (2011).</li><li>Qu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+gene-dependent+clearance+of+apoptotic+cells+during+embryonic+development.">Autophagy gene-dependent clearance of apoptotic cells during embryonic development.</a> Cell. 128, 931-946 (2007).</li><li>Grimsley, C., Ravichandran, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cues+for+apoptotic+cell+engulfment:+eat-me,+don't+eat-me+and+come-get-me+signals.">Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals.</a> Trends Cell Biol. 13, 648-656 (2003).</li><li>Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clearance+of+apoptotic+cells:+getting+rid+of+the+corpses.">Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses.</a> Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).</li><li>Haller, T., Dietl, P., Deetjen, P., Volkl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lysosomal+compartment+as+intracellular+calcium+store+in+MDCK+cells:+a+possible+involvement+in+InsP3-mediated+Ca2++release.">The lysosomal compartment as intracellular calcium store in MDCK cells: a possible involvement in InsP3-mediated Ca2+ release.</a> Cell Calcium. 19, 157-165 (1996).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+laser+scanning+microscopy+of+apoptosis+in+organogenesis-stage+mouse+embryos.">Confocal laser scanning microscopy of apoptosis in organogenesis-stage mouse embryos.</a> Cytometry. 33, 348-354 (1998).</li><li>Zucker, R. M., Hunter, E. S., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+morphology+in+mouse+embryos+by+confocal+laser+scanning+microscopy.">Apoptosis and morphology in mouse embryos by confocal laser scanning microscopy.</a> Methods. 18, 473-480 (1999).</li><li>Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+programmed+cell+death+in+situ+via+specific+labeling+of+nuclear+DNA+fragmentation.">Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.</a> J. Cell Biol. 119, 493-501 (1992).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Chiang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manifestation+of+the+limb+prepattern:+limb+development+in+the+absence+of+sonic+hedgehog+function.">Manifestation of the limb prepattern: limb development in the absence of sonic hedgehog function.</a> Dev. Biol. 236, 421-435 (2001).</li><li>Ishibashi, M., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sonic+hedgehog-dependent+signaling+relay+regulates+growth+of+diencephalic+and+mesencephalic+primordia+in+the+early+mouse+embryo.">A sonic hedgehog-dependent signaling relay regulates growth of diencephalic and mesencephalic primordia in the early mouse embryo.</a> Development. 129, 4807-4819 (2002).</li><li>Schuldiner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+neuronal+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells.</a> Brain Res. 913, 201-205 (2001).</li><li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro.">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li><li>Dumont, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+peroxide-induced+apoptosis+is+CD95-independent,+requires+the+release+of+mitochondria-derived+reactive+oxygen+species+and+the+activation+of+NF-kappaB.">Hydrogen peroxide-induced apoptosis is CD95-independent, requires the release of mitochondria-derived reactive oxygen species and the activation of NF-kappaB.</a> Oncogene. 18, 747-757 (1999).</li><li>Hampton, M. B., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+regulation+of+caspase+activity+by+hydrogen+peroxide:+implications+for+apoptosis.">Dual regulation of caspase activity by hydrogen peroxide: implications for apoptosis.</a> FEBS Lett. 414, 552-556 (1997).</li><li>Wood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cells+engulf+and+clear+apoptotic+footplate+cells+in+macrophageless+PU.1+null+mouse+embryos.">Mesenchymal cells engulf and clear apoptotic footplate cells in macrophageless PU.1 null mouse embryos.</a> Development. 127, 5245-5252 (2000).</li><li>Scott, R. C., Juhasz, G., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+autophagy+by+Atg1+inhibits+cell+growth+and+induces+apoptotic+cell+death.">Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death.</a> Curr. Biol. 17, 1-11 (2007).</li><li>Rodriguez-Enriquez, S., Kim, I., Currin, R. T., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracker+dyes+to+probe+mitochondrial+autophagy+(mitophagy)+in+rat+hepatocytes.">Tracker dyes to probe mitochondrial autophagy (mitophagy) in rat hepatocytes.</a> Autophagy. 2, 39-46 (2006).</li><li>Bampton, E. T., Goemans, C. G., Niranjan, D., Mizushima, N., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+autophagy+visualized+in+live+cells:+from+autophagosome+formation+to+fusion+with+endo/lysosomes.">The dynamics of autophagy visualized in live cells: from autophagosome formation to fusion with endo/lysosomes.</a> Autophagy. 1, 23-36 (2005).</li><li>Boya, P., Mellen, M. A., de la Rosa, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+autophagy+is+related+to+programmed+cell+death+during+the+development+of+the+nervous+system.">How autophagy is related to programmed cell death during the development of the nervous system.</a> Biochem. Soc. Trans. 36, 813-817 (2008).</li><li>Galluzzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).</li><li>Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+in+higher+eukaryotes.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy in higher eukaryotes.</a> Autophagy. 4, 151-175 (2008).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Apoptoz Önemli diğerlerinden ayıran kaspaz aktivitesinin tespiti ile birlikte TUNEL yöntemi ile DNA hasar tespiti, (mAb veya ZVAD-FMK olarak bağlayıcı bir molekül ile algılanır), hücresel değişikliklerin gözlenmesi ve fosfatidilserin sunumu (PS dahil membran yüzeyinde) (Annexin V bağlama tarafından algılanır). Bu testlerin her biri ile bazı dezavantajları vardır. Örneğin, TUNEL yöntemi içinde kullanılan terminal transferaz birkaç hücre tabakası ötesine nüfuz etmez. Ayrıca Annexin V gibi ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td></td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> LysoTracker Kırmızı DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> # L-7528 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks BSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14025-076 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMD </td><td> EM-PX0055-3 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> VEKTÖR </td><td> H-1200 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10-013-CV </td><td></td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler </td><td> Cellgro </td><td> 25-025-CI </td><td></td></tr><tr><td> Sodyum piruvat </td><td> Cellgro </td><td> 25-000-CI </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.02 </td><td></td></tr><tr><td> Kalem-Strep </td><td> Invitrogen </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> b-merkaptoetanol, 50 mM </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td></td></tr><tr><td> LABTEK-II Odası slaytlar (8-de) </td><td> Nalge Nunc Uluslararası </td><td> 154534 </td><td></td></tr><tr><td> % 0.1 jelatin </td><td> Millipore </td><td> ES-006-B </td><td></td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (D-PBS) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Çözüm Tarifler 4% Paraformaldehyde 100 ml için: <ol><li> 4 g paraformaldehit, 90 ml H2O, ve NaOH (2N NaOH, bir damla) karıştırılır. Eğer pH artırmak için bazı NaOH kadar paraformaldehid çözüm girmeyeceğim. </li><li> 60 karıştırın ve ısı ° C Tüm toz çözüm (~ 10-20 dakika) kadar. Isıtmayın. </li><li> 100 ml&#39;lik bir nihai hacim elde etmek için ~ 10 ml PBS 10x ekleyin. </li><li> Uygun (~ 10 mi veya ~ 40 mi) alikots içinde -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> Uyarı: &#39;fırfır&#39; şeklinde (ufak topaklar sıkıştırılmış) içinde paraformaldehit daha az toz halinde olan ve bu nedenle de bir başlık dışında ölçülebilir. Ancak yine de bir koruyucu toz maskesi (N95 giymeliEn az) kullanım sırasında. EB Kültür Medya 500 ml EB Medya için: <table border="1"><tbody><tr><td> DMEM: </td><td> 404.5 ml&#39;lik </td></tr><tr><td> FBS: </td><td> 75.0 ml </td></tr><tr><td> L-Glutamine: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> Non-esansiyel amino asitler: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> Sodyum piruvat: </td><td> 5.0 mL </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol: </td><td> 500ul </td></tr></tbody></table></td></tr></tbody></table>

use of lysotracker to detect programmed cell death in embryos and differentiating embryonic stem cells

Programlanmış hücre ölümü (PCD) normal doku homeostazı muhafaza etmek ve embriyolojik gelişimi sırasında doku ve organların 1,2,6,7 şekillendirmeye yetişkinlerde görülür. Gelişimi sırasında, toksik kimyasallar ve genetik değişiklikler PCD bir artışa neden olabilir veya gelişimsel anomalileri ve doğum kusurlarına 3-5 sonuçlanan PCD kalıplarını değiştirebilirsiniz. Bu defektlerin etyolojisi anlamak için, embriyo çalışmada embriyonik kök (ES) hücreler ayırt kullanabilirsiniz in vitro tayinlerde ile tamamlanabilir. Apoptoz kaspaz enzim kaskad etkinleştirmek için sinyal içsel ve dışsal hem de içerir PCD iyi çalışılmış şeklidir. Karakteristik hücre değişiklikleri zarı blebbing, nükleer daralma ve DNA fragmantasyonu içerir. PCD diğer formları kaspaz aktivasyonunun içermeyen ve uzun otofaji ve nihai sonucu olabilir. Ne olursa olsun PCD yolunun, ölen hücrelerin çıkarılması gerekir. Erişkinlerde, bağışıklık hücrelerinin perfembriyolarda, bağışıklık sistemi henüz oluşmamış, nerede kaldırma alternatif bir mekanizma ile oluşur ise, bu fonksiyonu yapýnýz. Bu mekanizma alarak komşu hücreleri (&quot;non-profesyonel fagositler&quot; denir) içeren bir fagositik rol onlar ölüyor hücre ve yutmak 8-10 yüzeyinde sinyal &#39;ye beni&#39; tanır. Yutulma sonra, kalıntı bozulması için lizozom getirilir. Böylece bağımsız PCD mekanizması, lizozomal aktivite artışı artan hücre ölümü ile ilişkili olabilir. PCD, kalın dokular ve çok katmanlı ayırt kültürlerde lizozomlar görselleştirmek için basit bir tahlil incelemek yararlı olabilir. LysoTracker bu tür boya lizozom 11-13 gibi asidik hücre içi bölmeler içinde tutulan bir yüksek derecede çözünür küçük bir moleküldür. Boya difüzyon ile ve dolaşım yoluyla alınır. Penetrasyon kalın dokular ve çok katmanlı kültürlerinde PCD bir engel, görselleştirme olmadığı 12,13 mümkündür </&gt; sup. Işlem, bir terminalin giriş / geçirgenlik transferaz gerektirir çünkü aksine, TUNEL (Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme) analizi, 14, küçük örnekler, histolojik bölümler ve tek tabakalı kültürler ile sınırlıdır. Yayılır ve çözücüler tarafından çözülür Anilin mavisi, aksine, LysoTracker Kırmızı DND-99 düzeltilebilir, parlak, ve kararlı. Boyama bütün montaj veya sulu veya çözücü bazlı montaj medya 12,13 kullanarak bölümünde standart floresan veya konfokal mikroskopi ile görüntülenebilmektedir. Burada normal ve sonik kirpi boş fare embriyolarının PCD bakmak için bu boya kullanılarak protokolleri tanımlar. Buna ek olarak, ES hücre kültürlerinde ayırt PSD analizi gösteren basit bir miktar yöntem sunuyoruz. Özet olarak, LysoTracker boyama PCD saptanmasında diğer yöntemler için büyük bir tamamlayıcı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Embriyolar yılında Programlı Hücre Ölümü Algılama LysoTracker kullanımı ve Embriyonik Kök Hücreler Farklılaşan

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

use-lysotracker-to-detect-programmed-cell-death-embryos

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

Cell Death

SCIENTISTS IN ACTION

23.0K Görüntüleme.  University of Southern California. Biz fare embriyolarının programlanmış hücre ölümü bölgeleri (PCD) ve LysoTracker adlı oldukça çözünür boya kullanarak embriyonik kök (ES) hücre kültürleri ayırt görselleştirmek için basit bir protokol mevcut.

Video: Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

6.5 DPC Fare Embriyolar diseksiyonu

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Biyoloji

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Immunosurgery İnsan Embriyonik Kök Hücreleri türetilmesi

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Embriyonik Kök Hücre Tedavi Hindlimb İskemi Türetilmiş Endotel Hücreleri

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Elektron Mikroskobu için embriyo Hazırlık Drosophila Embriyonik kalp tüpü

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Fare Embriyonik Germinal Hücreleri İzolasyon ve türetilmesi

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Video Bioinformatics Analysis of Human Embryonic Stem Cell Colony Growth

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer software.  Video bioinformatics is a powerful quantitative approach for extracting spatio-temporal data from video images using computer software to perform dating mining and analysis. In this article, we introduce a video bioinformatics method for quantifying the growth of human embryonic stem cells (hESC) by analyzing time-lapse videos collected in a Nikon BioStation CT incubator equipped with a camera for video imaging. In our experiments, hESC colonies that were attached to Matrigel were filmed for 48 hours in the BioStation CT.  To determine the rate of growth of these colonies, recipes were developed using CL-Quant software which enables users to extract various types of data from video images.  To accurately evaluate colony growth, three recipes were created. The first segmented the image into the colony and background, the second enhanced the image to define colonies throughout the video sequence accurately, and the third measured the number of pixels in the colony over time.  The three recipes were run in sequence on video data collected in a BioStation CT to analyze the rate of growth of individual hESC colonies over 48 hours. To verify the truthfulness of the CL-Quant recipes, the same data were analyzed manually using Adobe Photoshop software. When the data obtained using the CL-Quant recipes and Photoshop were compared, results were virtually identical, indicating the CL-Quant recipes were truthful. The method described here could be applied to any video data to measure growth rates of hESC or other cells that grow in colonies. In addition, other video bioinformatics recipes can be developed in the future for other cell processes such as migration, apoptosis, and cell adhesion.  

Video bioinformatics is the automated processing, analysis, understanding, and data mining of biological spatio-temporal data extracted from microscopic videos. The purpose of this article is to demonstrate a method for measuring human embryonic stem cell colony growth using a video bioinformatics method.

Video Biyoinformatik İnsan Embriyonik Kök Hücre Colony Büyüme Analizi

Because video data are complex and are comprised of many images, mining information from video material is difficult to do without the aid of computer ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Embriyonik Kök Hücreler farklılaşma oligodendrosit Öncüleri

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.