Bu yöntem, nöroprotektif doğal bileşikler Modeli ile ilgili tarama hakkında nörolojik ve geleneksel ağız hekimliği araştırma alanlarında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı enfeksiyon hacminin daha yüksek prodüksebilitesi iskemik zamanlama dozuna uygun olmasıdır. Bu yöntemin görsel gösterimi, steril bir mikroskop kullanarak orta serebellar arterorijinal, orta serebellar arter içine çok ince bir uygulama eklemek için tipik olduğu gibi önemlidir.
Prosedürü gösteren Se-Eun Lee, benim laboratuvarımda okuyan bir okul öğrencisi olacak. Glycyrrhizae Radix et Rhizome ekstresi veya GRex hazırlamak için, ilk oda sıcaklığında beş günlük kuluçka için metanol iki litre glycyrrhizae Radix et Rhizome veya GR, 200 gram ekleyin. Kuluçka sonunda, çözeltiyi 5 mikrometre gözenek boyutuna sahip 0,26 milimetre kalınlığındafiltre kağıdıyla süzün.
Taze metanol bir litre GR kalıntısı ekleyin ve tekrar çözüm filtre. İki filtrates birleştirin ve filtre kağıt yeni bir parça ile süzün. Daha sonra GRex üretmek için dondurularak kurutmadan önce ekstresi vakum altında yoğunlaştırın.
GRex'i yönetime hazırlamak için dondurulmuş kurutulmuş ürünü dimetilsülfoksitle eritin ve karışımı %0,9 fizyolojik salinle seyreltin. Daha sonra çözeltiyi 0,45 mikrometrelik şırınga filtresinden geçirin, ve dmso'nun son konsantrasyonunu %5'ten daha az bir oranda ayarlayın Bir fare orta serebral arter oklüzyon modeli veya MCAO'yu kurmak için, anestezialtı haftalık 22 ila 25 gram erkek C57BL/6 farede kuyruk uyaranlarına yanıt verme eksikliğini onaylayın ve fareyi bir termometreye bağlı 36,5 derecelik santigrat vücut ısısını tutan battaniyeye yerleştirin. Tıraş ve tüy dökücü krem ile farenin göğüs ve boyun tüm saç çıkardıktan sonra, bir stereomikroskop altında fare yerleştirin ve boyun merkezinde iki santimetrelik deri kesi yapmak.
Dikkatle sol ortak karotis arter izole, dış karotis arter, ve çevreleyen bağ dokularından internal karotid arter dalı, ve dış karotis arter ve ortak karotis arter ligate için bir 4.0-ipek sütür kullanın geçici olarak iç karotid arter içine kan akışını engellemek için yarım otostop ile. 0.1 ila 0.12 milimetre kalınlığında 11 milimetre uzunluğunda silikon kaplı 8.0-monofilament 4.0-ipek sütür internal karotis arter sol orta serebral arter kökeni için yerleştirin ve göreceli serebral kan akımı arter azalma ölçmek için bir lazer Doppler akış ölçer kullanın. Serebral arter tıkanmış iken iki saat boyunca kan damarına eklenen filament düzeltin.
Oklüzyon periyodunun sonunda, 22 saatlik reperfüzyon için kan akışını geri getirmek için filamenti dikkatlice çekin. Ve iki yarım otostop düğümleri ile beş yerde cilt dikiş için 3.0-ipek dikiş kullanın. Sonra anestezik kurtarma için kafese fare dönün.
Reperfüzyonun bitiminden bir saat sonra, sadece oral gavaj ile, deneysel hayvanlara kilogram vücut ağırlığı GRex başına 300 miligram uygulayın. MCAO'nun başlangıcından 24 Saat sonra, her deney hayvanının kafasının orta derisinde bir kesi yapın ve dura mater'i soyurken parietal kemikleri açılı enterler ile kırın. Beyni kafatasından dikkatlice izole edin ve bir milimetre kalınlığındaki dokuyu kesmek için bir fare beyin matrisi kullanın.
Standart protokollere göre%2 TTC çözeltisinde 17 dakika boyunca kesitleri lekeleyin. Ve örnekleri dijital kamerayla görüntülemeden önce en az 2 saat boyunca %10 formalin ile bölümleri düzeltin. Daha sonra ImageJ kullanarak her bölümün serebral enfarkt alanını analiz edin ve ölçün.
MCAO sonrası uygun deneysel zaman noktasında, her ötanazi edilmiş deneysel hayvanı 10 mililitre PBS ile transkardize edin ve ardından %4 paraformaldehit 10 mililitre. Beyinleri az önce gösterildiği gibi izole ettikten sonra, hasat edilen organları bir gecede %30 sakarozun 10 mililitresine batırın. Ertesi sabah, beyin dokusu örneklerini optimum kesme sıcaklık bileşime gömün.
Ve dokuları bir cyrostat üzerinde 15 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın. Bölümleri cam kaydıraklara monte edin ve bölümleri 1 dakika boyunca %80 etanolle batırın. H&E boyama için numuneleri 5 dakika hematoksilin solüsyonu ile etiketleyin ve ardından %1'lik asit alkolüniki daldırmasını takip edin.
Ardından, slaytları 30 saniye boyunca doymuş Lityum karbonat çözeltisi içine daldırın, ardından musluk suyunda 30 saniyelik bir yıkama ve Eosin çözeltisi ile 30 saniye lik karşı boyama. Bir musluk suyu yıkama ile fazla Eozin çözeltisi çıkarın ve 95 sonra% 100 etanol bir dakikalık artan daldırma ile slaytlar dehydrate. Daha sonra, slaytlar hava kurun, en az 10 dakika ksilen onları temizleyin ve montaj orta ile kapakları monte.
Krem menekşe boyama için, en az bir saat boyunca bir slayt ısıtıcı üzerinde% 80 etanol tedavi slaytlar yerleştirin, bir gecede kloroform ile seyreltilmiş% 50 etanol daldırma izledi. Ertesi sabah, 40 derecelik santigrat kuru fırında 10 dakika boyunca %0.1 krem menekşe ile slaytları lekeleyin, ardından 30 dakika boyunca %95 etanolte dehidratasyon ve iki beş dakikalık %100 etanol daldırma. Daha sonra, slaytlar iki beş dakikalık ksilen daldırma, hava kurutma ardından temizleyin.
Daha sonra ışık mikroskobu ile görselleştirme için montaj ortamı ile slaytlar monte. Sham-operated normal gruplarda serebral enfarktüs gözlenmez;kontrol de, tedavi edilmeyen MCAO hayvanlarda ise nispeten geniş bir hasarlı bölge aralığında gözlenir. GRex ile tedavi edilen model farelerde kilogram başına 300 miligramlık hasarlı dokuda istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gözlenmektedir.
H&E ve cresyl menekşe lekeli doku bölümlerinin histolojik analizi hücre sağkalım indeksini sağlar. Gerçekten de, H & E ve cresyl menekşe boyama yoğunlukları önemli ölçüde kontrol azalma, sham işletilen normal gruba göre tedavi edilmemiş MCAO grubu. GRex-tedavi hayvanlar, diğer taraftan, daha büyük bir histolojik bütünlük sergilemek, hem kontrol daha az nöronal hücre ölümü ima, tedavi edilmemiş ve sham-işletilen gruplar, iskemi reperfüzyon kaynaklı beyin hasarına karşı ekstre güçlü bir nöroprotektif etkisi düşündüren.
Bu işlem denerken, bu dönemde göreceli serebellar kan akışını izlemek için hatırlamak önemlidir. Ve proseslerin iletkenleri endotel tabakalarındaki zararları en aza indirmek için çok dikkatli
