Bu protokol, belirli hücre popülasyonlarında kesin ko-lokalizasyon analizleri sağlayan erken evre zebra balığı embroys kriyokesitleri üzerinde sıralı immünofloresan ve immünohistokimya için yeni bir prosedür göstermektedir. Bu protokolün en büyük avantajı esneklikolmasıdır. Doku morfolojisini, ekspresyonun eş lokalizasyonunu ve antikor uyumluluğunu en üst düzeye çıkarmak için tek bir kriyodite kullanarak immünoresans ve immünohistokimya tekniklerini birleştirir.
Bu protokol diğer balık veya amfibi modellere de uygulanabilir, çünkü bu araştırmacılar genellikle antikor bulunabilirliği ile benzer komplikasyonlarla karşı karşıya kalırlar ve genellikle benzer deneyler gerçekleştirin. Erken evre embriyo kriyokesitleri ile çalışmak zor olabilir, çünkü küçükler ve kriyokesitler zor olabilir, ancak gelişmiş hazırlık ve uygulama bu yöntemdeki tüm mücadeleleri hafifletmeye yardımcı olacaktır. Protokolümüzde belirli kullanım ve bakım gerektiren ve birinin tekniklerini gösterdiğini görmeden ustalaşmanın zor olabileceği birden fazla adım vardır.
Başlamak için, transfer önceki sabit ve kırk sekiz saat sonrası döllenme şeym zebrabalığı embriyoları bir tüp 15 25 OCT karışımı ile plastik bir kalıp için karışım herhangi bir transferi en aza indiren forceps kullanarak. Kalıbın yarısını OCT ortamıile doldurun ve embriyoları yavaşça karıştırın. Etiketli plastik kalıplar hazırlayın ve istenilen embriyoları boş etiketli plastik kalıplara aktarın, OCT ortamının taşınmasını en aza indirin.
Sonra yavaşça embriyolar ile kalıpların üstüne OCT orta ile doldurun. Görselleştirme için hafif stereo mikroskop altında çalışarak, embriyoları istenilen yönde düzenlemek için iğneler kullanın. Daha sonra hazırlanan kalıpları metal bir platformile yalıtımlı bir kapta yerleştirin ve kuru buz üzerinde dondurun.
Soğuk bir oda oluşturmak ve yaklaşık 30 dakika donmak için metal platformun üzerine yavaşça bir buz kovası yerleştirin. Eksi 20 santigrat derece ayarlanmış bir kriyostat kullanarak, yer ve doku izlemek için bir mikroskop üzerinde periyodik olarak bölümün derinliğini kontrol ederken 10 ila 12 mikrometre kalınlığında kriyokesitler gömülü embriyolar kesti. Bölümleri yüklü cam kaydırakların üzerine yerleştirin ve bir gecede oda sıcaklığında hava kurutun.
Slaytları 1X PBS'de beş dakika boyunca üç kez uygun bir kapta yıkayın. Kaydırakları nemli bir odada düz bir yüzeye yerleştirin. Slaytlarda sıvı tutmak için bölümleri anahatlamak için bir bariyer kalemkullanın.
Pipet 200 mikrolitre blok tampon bölüm başına ve oda sıcaklığında iki saat boyunca blok tampon kuluçka. Birincil antikor seyreltme hazırlayın ve tampon blok ve pipetleme ile iyice karıştırın. Blok arabelleği boşaltmak ve nemli hazneye dönmek için slaytları yavaşça uç.
Pipet 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisi bölüm başına slaytlar üzerine ve 200 mikrolitre blok tampon kontrol olarak uygun bölümlere üzerine. Deiyonize su ile dolu nemli bir odada bir gecede dört derece santigrat slaytlar kuluçka nem tutmaya yardımcı olmak için hazne kenarları mühür emin olun. Slaytları 1X PBS'de beş dakika boyunca üç kez ve uygun bir kapta yıkayın.
Yıkama sırasında ikincil antikor seyreltme hazırlayın ve tampon blok ve pipetleme ile iyice karıştırın. Nemli bir odada düz bir yüzeye slaytlar döşendikten sonra, bölüm başına ikincil antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin. 30 dakika boyunca karanlıkta oda sıcaklığında ikincil antikor çözeltisi slaytlar kuluçka.
Slaytları 1X PBS'de beş dakika boyunca üç kez uygun bir kapta yıkayın. Düz bir yüzeye slaytlar yerleştirdikten sonra, her bölüm üzerine nükleer boyama çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca kapalı kuluçka. Nükleer boyama çözeltisini boşalttınktan sonra, slaytları sertleşmeyen floresan montaj ortamı ve cam kapak lı bir şekilde monte edin.
Görüntülemeye kadar onları 4 santigrat derecede karanlıkta tutmayı sağlıyor. Slaytları 1X PBS ile tek tek kaplara yerleştirin ve bir gecede dört derece santigrat derecede düz bir şekilde saklayın, kapak kaymalarını yeterince gevşetmek için hafifçe çalkalayın ki ajite olduklarında çıkacaklar. Kapak fişe bastırmamaya veya kapak fişini elle çıkarmaya çalışmamaya özen inmemeye devam edin, ancak en az zorlama hareketi ile çıkana kadar bekleyin.
Kapak fişleri çıkarıldıktan sonra, slaytları yavaşça taze 1X PBS içeren bir kaba aktarın. 1X PBS'yi çıkarın ve slaytları oda sıcaklığında beş dakika boyunca iyonik olmayan bir yüzey aktif antonun %0,1'i ile 1X tris tamponlu salinle inkübün. 15 dakika oda sıcaklığında% 3 hidrojen peroksit çözeltisi slaytlar kuluçka.
Sonra slayt düz yatıyordu ve yüzeye akıllıca blok arabellek damla ekleyin. Blok arabelleği boşaltmak için slaytları yavaşça uç. Bölümlerin etrafındaki alanı kurulayın ve slaytları nemli bir odaya yerleştirin.
Slaytlar üzerine bölüm başına birincil antikor çözeltisi 200 mikrolitre ekleyin ve nemli odada dört derece santigrat gecede kuluçka. Birincil antikor çözeltisini boşaltmak için slaytları hafifçe uçlayın ve 1X TBST'de beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra her bölüme blokaj ı azaltarak arka plan kullanmaya hazır uygulayın ve oda sıcaklığında nemli odada 20 dakika kuluçkaya yatın.
Blok arabelleği boşaltmak için slaytları yavaşça uç. Dikkatlice bölümlerin çevresindeki alanı kuruve nemli bir odada düz slaytlar yerleştirin. Her bölüme ikincil antikor solüsyonu kullanmaya hazır bir solüsyon uygulayın ve oda sıcaklığında nemli odada 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Sekonder antikor çözeltisini boşaltmak için slaytları hafifçe uçlayın ve 1X TBST'de beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Bölümlerin etrafındaki alanı kuruttuktan sonra, slaytları düz bir yüzeye yerleştirin ve her bölüme HRP kromojenik substratının 200 mikrolitresini ekleyin. Substrat ilk slayt abaşve üç dakika oda sıcaklığında kuluçka uygulandı zamanlayıcı başlatın.
Substrat çözeltisini boşaltın. Slaytları 1X PBS ile uygun bir kapta kısa bir süre durulayın ve hafif ajitasyonla beş dakika boyunca iki kez deiyonize suda yıkayın. 30 saniyeye kadar hematoksilin boyama çözeltisine yerleştirerek slaytları lekeleyin ve her biri deiyonize suda beşer dakika boyunca üç kez yıkayın.
Bir dakika scott's Tapwater içeren bir kapta slaytlar kuluçka ve sonra deiyonize suda beş dakika boyunca tekrar üç kez yıkayın. Deiyonize su ve kimyasal bir başlık içinde ksilen seyreltilmiş etanol sınıfları bir dizi slaytlar dehydrate. Ksilenden slaytlar çıkardıktan sonra hemen tolüen bazlı montaj ortamı ekleyin ve bir kapak kayma yerleştirin.
Kapak kayması sırasında başarıyı sağlamak için, slaydın bir tarafından diğerine doğru yavaşça çalışmak ve dokuyu gizleyen kabarcıkları önlemek için kapak kaymasını yavaşça düşürmek önemlidir. Son olarak, 100X büyütmede bileşik ışık mikroskobu ve dijital kamera kullanarak slaytları görselleştirin ve görüntüleyin. Burada aynı anda çoğalan hücreleri ve donör hücreleri tespit ve aktif olarak çoğalan donör hücreleri tespit etmek için kullanılan özel antikorlar.
Hem immünoresans hem de immünohistokimyadan sonra tek tek hücreleri doğru bir şekilde tanımlamak için yüksek kaliteli görüntüler üretmek esastır. Görüntü bindirmegerçekleştirmek için bir görüntü analizi programı kullanıldı. Bu işlemi denerken immünohistokimya sırasında leke kaymalarını yeterince lekelemek ve saymak en önemli yöntemdir.
Bu işlemden sonra, farklı antikor kombinasyonları, doku tipleri veya türler gibi orijinal protokolde değişiklik olarak ek yöntemler yapılabilir. Görüntüler, ilgili verileri elde etmek için çeşitli şekillerde de analiz edilebilir. Bu teknik, hücreden hücre etkileşimine karşı araştırmanın bir yolu olarak eş lokalizasyon alabilen ve birden fazla genetik geçmişe bakmamızı sağladı ve ayrıntılı ko-lokalizasyon analizi gerektiren diğer tekniklere benzer şekilde uygulanabilir.
İmmünohistokimyadaki reaktiflerin çoğu tehlikelidir ve buna göre tedavi edilmelidir. Kaputta etanol, ksilen ve montaj serti ile çalışılmalıdır. DAB atıkları tehlikeli atık olarak bertaraf edilmeli ve dab sonrası yıkıntılar ağartılmalıdır.
