Bu yöntem, in vitro akciğer kanseri hücrelerinde iki mikroRNA aktivitesini belirlemek için gerekli laboratuvar teknikleri anlamak ve gerçekleştirmek yardımcı olacaktır. Akciğer kanseri dünya çapında kansere bağlı ölüm önde gelen nedenidir. Burada, temel laboratuvar metodolojilerinden gen ekspresyonu analizi ve antikor protein mikroRNA'sı gibi daha karmaşık protokollere kadar uzanan ve özellikle mikroRNA'nın eylemlerinin etkisini tanımlamak için kullanılan teknikler salıyoruz.
Aşağıdaki yöntemler bize iki mikroRNA, microRNA 143 ve microRNA 506 etkisi ile ilgili anahtar sorulara cevap yardımcı olacaktır, akciğer kanseri hücrelerinde hücre döngüsünü düzenleyen. Hücre transfeksiyonu, RNA ekstraksiyonu, kantitatif gerçek zamanlı PCR ve mikroRNA analizi gibi farklı laboratuvar tekniklerini saklı atıyoruz. Sunumumuzun bu analizlerin başarıyla tamamlanmasına katkıda bulunacağını umuyoruz.
İlk olarak, qPCR veya mikro dizi analizi kullanarak gen ekspresyonu gerçekleştirmek için, RNA ve protein ekstraksiyonu için yeterli uygun bir şişe kültürlü hücreleri koltuk. Sonra medya ile bir gecede kuluçka 10 yüzde FBS ve yüzde 1 penisilin streptomisin ile takviye. Ertesi gün, her biri 100 nanomolar konsantrasyonda ortamda mikroRNA 143 ve mikroRNA 506'yı seyrelterek mikroRNA örneğini transfeksiyon için hazırlayın.
Kuvözdeki şişeyi çıkarın ve ortamı çıkarın. 1x PBS ile yıkayın. İşlenmemiş tüm denetimler yalnızca hücreleri olan eksik ortam içerir.
Hücreleri transfeksiyon media ile altı saat kuluçkaya yatırın. Altı saat sonra, ortamı çıkarın ve dört mililitre taze, eksiksiz ortamla değiştirin. 24 saat ve 48 saat sonra trypsinizasyon ile hücreleri hasat.
Daha sonra, her tüpte 1x PBS ile iki kez yıkayın ve supernatant çıkarın. Daha sonra RNA ekstraksiyonu gerçekleştirmek için, eksi 80 santigrat derece hücreleri dondurmak. RNA ekstraksiyonu, üreticinin talimatları doğrultusunda bir RNA kiti kullanılarak gerçekleştirildi.
İlk olarak, eksi 80 santigrat derece tüpleri çıkarın ve çözülmeye izin verin. Hücre zarını kırmak için 300 mikrolitre lysis tampon ve pipet ekleyin. Yüzde 100 ultra saf etanol eşit hacim ekleyin.
Sonra iyice karıştırın ve ayrı sütunda yerleştirin. Santrifüj ve akış-through kaldırın. Tampon kaldırmak için yıkama ve tampon ve santrifüj 400 mikrolitre ekleyin.
Her numunede 75 mikrolitre VNA sindirim tamponu ile 5 mikrolitre DNAse 1 ekleyin ve 15 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra numuneyi 400 mikrolitreRNA hazırlık tamponu ile yıkayın. Daha sonra, RNA yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
Şimdi, sütuna çekirdeksiz su ekleyin, santrifüj ve sonra RNA toplamak. RNA konsantrasyonu ölçün. Bu aşamada, RNA dizilimi için iki mikrogram RNA örneği gönderilebilir.
Termocycler kullanarak, metin bölümünde açıklanan protokole göre cDNA hazırlayın. 10 mikromolar konsantrasyonuna DNAse RNAse içermeyen su ile ileri ve geri astar çözeltileri hazırlayın. Her genin örnek sayısına göre tespit edilmesi için bir ana karışım hazırlayın.
Her cDNA örneği için reaksiyon miktarı metinde açıklanan tabloya göre yapılır. Her örneği kendi kuyularına yerleştirin. QPCR için, örnekleri takip etmek için 96 iyi plaka düzenine sahip bir Excel belgesi hazırlamak her zaman iyidir.
Her örnek ve analiz gen için, üçlemeler, ya da en azından yinelenen ler kendi reaksiyon gerçekleştirmek. Plastik plakayı şeffaf, optik berrak plastik mühürleyici ile kapatın. Bu yanlış sinyal üretebilir gibi, parmakları ile ince, plastik tabaka dokunmaktan kaçının.
Hızlı bir şekilde kendi kuyuların altına tüm reaktifler karıştırmak için plaka spin. Ardından, örnek plakayı nicel, gerçek zamanlı bir PCR makinesi kullanarak çalıştırın. QPCR makinesi tarafından oluşturulan CT değerlerini alın ve bağıl gen ekspresyonu için analiz edin.
Bu videonun önceki bölümünde açıklandığı gibi hücreleri transfect. Ayrı her örnekten hasat hücreleri, tripsinizasyon için 15 mililitre steril tüpler. Daha sonra hücreleri 1x PBS ile iki kez yıkayın, 751G'de beş dakika santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın.
Bir pipet aracılığıyla 200 mikrolitre buz gibi 1x PBS ekleyerek paleti yeniden askıya alın ve kırın. Hücreleri düzeltmek için tüpü nazikçe girdap larken, yüzde 70 buz gibi etanol, tüp için damla akıllıca iki mililitre ekleyin. Tüpleri oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın ve bir saat boyunca dört derece ye yerleyin.
Tüpleri dört santigrat dereceden ve santrifüjden çıkarın. 2ml buz gibi PBS ve girdap ekleyin ve sonra santrifüj ile supernatant kaldırın. Her numuneye sırasıyla, her numunede, konsantrasyonu 50 ve 200 mikrogram olan propidium iyodür ve ribonükle azas a içeren 1x PBS'nin 500 mikrolitresini ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Numuneleri ışıktan koruyarak uygun tüplere aktarın ve akış sitometresi üzerinde çalıştırın. Bu deney, mikroRNA tedavisi ile değiştirilen tüm hücre döngüsü yolu proteinlerinin ekspresyonunu belirlemektir. Transfeksiyon bölümünde açıklanan prosedüre göre protein örnekleri toplayın ve BCA testi ile ölçün.
Oda sıcaklığına getirmek ve nemi gidermek için denemeden bir saat önce slaytları eksi dört santigrat dereceden çıkarın. 70 mikrogram protein örneği alın ve üreticinin talimatlarına göre örnek slaytlar hazırlayın, bu da metin bölümünde adım adım açıklanmıştır. Burada dikkat etmek için, ultra saf deiyonize su ile slaytlar düzgün yıkama başka önemli bir adımdır, Bu slaytların arka plan azaltmaya yardımcı olacaktır gibi.
Ayrıca, bu denemede örnek slaytları son adıma kadar kurutmamak çok önemlidir. Son olarak, mikro dizi makinesini kullanarak slaydı tarayıp verileri analiz edin. CDK1, CDK4 ve CDK6 gen ekspresyonunu belirlemek için mikroRNA ile tedavi edilen örneklerin qPCR analizi yapıldı.
Bu genler normal ve kanser hücrelerinin hücre döngüsünü düzenleyen, ve tümör ilerlemesini inhibe etmek için bir araç olarak hedeflenmiştir. Veriler mikroRNA 143 ve 506 ile tedavi nedeniyle bu genlerin downregulatory etkisini göstermiştir. Akış sitometrisinden elde edilen hücre döngüsü dağılım verileri G0 ve G1 fazında bir popülasyon artışı ve mikroRNA 143 ve 506'nın kombinatoryal tedavisinin etkisiyle S fazında popülasyon azaldığını göstermiştir.
Hücre döngüsünün spesifik mikro dizi analizinde yaklaşık 60 genin protein ekspresyonu değişiklikleri tespit edildi. Temsil edilen ısı haritası, CDK2, Helen 1 ve 3, RE2F1 gibi hücre döngüsünün ilerlemesi ve çoğalması için gerekli olan birden fazla genin protein düzeyinde ki regülasyonu göstermiştir. Buna karşılık, proteinler yaygın olarak yetiştirilen inhibitör etkisi ile tanınan upregulated edildi.
Sonuçlar yarı-nicel olmasına ve daha fazla analiz gerektirmese de, mikro dizi analizi yolun aktivitesine hızlı bir genel bakış sağlar. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerdeki mikroRNA aktivitesinin tanımlanmasında size yardımcı olacak temel ve karmaşık laboratuvar deneylerini gerçekleştirebileceğinize inanıyoruz.
