שיטה זו תסייע להבין ולבצע טכניקות מעבדה הדרושות כדי לזהות את הפעילות של שני microRNA בתאי סרטן ריאות במבחנה. סרטן ריאות הוא הגורם המוביל למוות מסרטן ברחבי העולם. כאן, אנו מציגים טכניקות המשתרעות ממתודולוגיות מעבדה בסיסיות לפרוטוקולים מורכבים יותר, כגון ניתוח ביטוי גנים ומיקרו-רנ"א של חלבון נוגדנים, המשמשות במיוחד לזיהוי ההשפעה של פעולות microRNA.
השיטות הבאות יעזרו לנו לענות על שאלות מפתח לגבי ההשפעה של שני microRNAs, microRNA 143 ו microRNA 506, על ויסות מחזור התא בתאי סרטן ריאות. אנו מציגים טכניקות מעבדה שונות, כמו transfection תאים, מיצוי RNA, PCR בזמן אמת כמותי וניתוח microRNA. אנו מקווים שהמצגת שלנו תתרום להשלמת ניתוחים אלה בהצלחה.
ראשית, מושב התאים המתורבתים בבקבוק המתאים מספיק עבור RNA והפקת חלבון, כדי לבצע ביטוי גנים באמצעות ניתוח qPCR או מיקרו מערך. ואז לדגר לילה עם מדיה בתוספת 10 אחוז FBS ו 1 אחוז פניצילין סטרפטומיצין. למחרת, להכין את מדגם microRNA עבור transfection על ידי דילול microRNA 143 ו microRNA 506 במדיה בריכוז של 100 nanomolar כל אחד.
מוציאים את הבקבוק מהאספה ומסירים את התקשורת. לשטוף עם 1x PBS. כל הפקדים שאינם מטופלים יכילו רק מדיה לא שלמה עם תאים.
להחגירה את התאים עם מדיה transfection במשך שש שעות באינקובטור. לאחר שש שעות, להסיר את התקשורת ולהחליף עם ארבעה מיליליטר של מדיה טרייה, מלאה. לקצור את התאים לאחר 24 שעות ו 48 שעות על ידי טריפסיניזציה.
לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם 1x PBS בכל צינור ולהסיר על טבעי. על מנת לבצע מיצוי RNA במועד מאוחר יותר, להקפיא את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס. מיצוי RNA בוצע באמצעות ערכת RNA, בהתאם להוראות היצרן.
ראשית, להסיר את הצינורות ממינוס 80 מעלות צלזיוס ולאפשר להפשיר. הוסף 300 מיקרוליטרים של מאגר תיזה ופיגט למעלה ולמטה כדי לשבור את קרום התא. הוסף נפח שווה של 100 אחוז אתנול טהור במיוחד.
לאחר מכן מערבבים היטב וממקום בעמודה מופרדת. צנטריפוגה ולהסיר את הזרימה דרך. הוסף 400 מיקרוליטרים של שטיפה וחוצץ וצנטריפוגה כדי להסיר את המאגר.
הוסף 5 microliters של DNAse 1 עם 75 מיקרוליטר VNA חיץ עיכול בכל מדגם, דגירה במשך 15 דקות. לאחר מכן לשטוף את המדגם עם 400 מאגר הכנה RNA microliter. לאחר מכן, לשטוף פעמיים עם חיץ לשטוף RNA.
עכשיו, להוסיף מים ללא גרעין לעמוד, צנטריפוגה ולאחר מכן לאסוף את RNA. למדוד את ריכוז RNA. בשלב זה, שני מיקרוגרם של דגימת RNA ניתן לשלוח עבור רצף RNA.
הכן את ה- cDNA בהתאם לפרוטוקול המתואר במקטע הטקסט, באמצעות התרמוצ'ילר. הכן פתרונות פריימר קדימה ואחרץ עם מים נטולי DNAse RNAse לריכוז של 10 מיקרומולרים. הכינו תערובת ראשית לכל גן לגילוי בהתאם למספר הדגימות.
עבור כל דגימת cDNA, כמות התגובה היא בהתאם לטבלה המתוארת בטקסט. מניחים כל דגימה ל בארות שלהם. עבור qPCR, זה תמיד טוב להכין מסמך Excel עם פריסת לוח 96 היטב, על מנת לעקוב אחר הדוגמאות.
עבור כל מדגם ותותח גן, בצע את תגובתם ב- triplicates, או לפחות כפילויות. לאטום את צלחת הפלסטיק עם איטום פלסטיק שקוף וברור אופטית. הימנע מנגיעה בשכבה הדקה והפלסטית באצבעות, מכיוון שזה יכול לייצר אות שווא.
במהירות לסובב את הצלחת כדי לערבב את כל reagents לתחתית בארות שלהם. לאחר מכן, הפעל את לוחית הדגימה באמצעות מכונת PCR כמותית בזמן אמת. קבל את ערכי ה- CT שנוצרו על-ידי מכונת qPCR ונתח עבור ביטוי גנים יחסי.
התבסוף בתאים כמתואר בסעיף הקודם של סרטון וידאו זה. קציר תאים מכל מדגם בצינורות סטריליים נפרדים, 15 מיליליטר עבור טריפסיניזציה. לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים עם 1x PBS, על ידי צנטריפוגה ב 751G במשך חמש דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
להשעות מחדש ולשבור את הצבעים על ידי הוספת 200 מיקרוליטר קר כקרח 1x PBS דרך פיפטה. הוסף שני מיליליטר של 70 אחוז אתנול קר כקרח, טיפה חכם לצינור, תוך מערבולת הצינור בעדינות כדי לתקן את התאים. צינורות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ומ מניחים אותם בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
מוציאים את הצינורות מארבע מעלות צלזיוס וצנטריפוגה. מוסיפים 2 מ"ל PBS קר כקרח ומערבולת, ולאחר מכן להסיר את העל טבעי על ידי צנטריפוגה. הוסף 500 microliters של 1x PBS המכיל פרופידיום יודיד ריבונוקלאז A עם ריכוז 50 ו 200 מיקרוגרם למיליליטר, בהתאמה, בכל מדגם, ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
להעביר דגימות לתוך צינורות מתאימים, הגנה מפני אור, ולהפעיל על ציטומטר זרימה. ניסוי זה הוא לזהות את כל החלבונים של מסלול מחזור התא שהשתנה על ידי טיפול microRNA. לאסוף דגימות חלבון על פי ההליך המתואר בסעיף transfection, לכמת עם הבדיקה BCA.
הסר את השקופיות ממינוס ארבע מעלות צלזיוס שעה אחת לפני הניסוי כדי להביא לטמפרטורת החדר ולהסיר לחות. קח 70 מיקרוגרם של דגימות חלבון והכן שקופיות מדגם בהתאם להוראות היצרן, אשר מתואר גם צעד אחר צעד בסעיף הטקסט. כאן כדי לציין, שטיפה נכונה של מגלשות עם מים deionized טהור במיוחד הוא צעד חשוב נוסף, כמו זה יעזור להפחית את הרקע של המגלשות.
בנוסף, זה מאוד קריטי בניסוי זה לא לייבש את שקופיות המדגם עד השלב הסופי. לבסוף, סרוק את השקופית באמצעות מכונת מיקרו-מערך ונתח את הנתונים. ניתוח qPCR של הדגימות שטופלו במיקרו-רנ"א התקיים כדי לקבוע את ביטוי הגנים של CDK1, CDK4 ו- CDK6.
גנים אלה לווסת את מחזור התאים של תאים נורמליים וסרטניים, כבר ממוקד כאמצעי לעיכוב התקדמות הגידול. הנתונים הראו את ההשפעה downregulatory של גנים אלה עקב הטיפול עם microRNA 143 ו 506. נתוני התפלגות מחזור התאים ממחזור הזרימה הדגימו גידול באוכלוסייה בשלב G0 ו- G1, וירידה באוכלוסייה בשלב S עקב השפעת הטיפול הקומבינטורי של microRNA 143 ו- 506.
ניתוח המיקרו-מערך הספציפי של מחזור התא זיהה שינויים בביטוי החלבון של כ-60 גנים. מפת החום המיוצגת הצביעה על ירידה ברמת החלבון של מספר גנים הדרושים להתקדמות מחזור התא והתפשטותו, כגון CDK2, הלן 1 ו- 3, RE2F1. לעומת זאת, חלבונים המוכרים בדרך כלל על ידי ההשפעה המעכבת הבוגרת שלהם היו מוסדרים.
למרות שהתוצאות הן כמותיות למחצה ונדרש ניתוח נוסף, ניתוח המיקרו-מערך מספק סקירה מהירה של פעילות המסלול. אנו מאמינים, לאחר צפייה בסרטון זה, תוכל לבצע ניסויי מעבדה בסיסיים ומורכבים שיסייעו לך בזיהוי פעילות microRNA בתאים.
