Este método ayudará a entender y realizar las técnicas de laboratorio necesarias para identificar la actividad de dos microARN en las células de cáncer de pulmón in vitro. El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo. Aquí, presentamos técnicas que abarcan desde metodologías básicas de laboratorio hasta protocolos más complejos, como el análisis de expresión génica y el microARN de proteínas de anticuerpos, específicamente utilizadas para identificar el efecto de las acciones del microRNA.
Los siguientes métodos nos ayudarán a responder preguntas clave sobre el efecto de dos microRNAs, microRNA 143 y microRNA 506, en la regulación del ciclo celular en las células de cáncer de pulmón. Presentamos diferentes técnicas de laboratorio, como la transfección celular, la extracción de ARN, la PCR cuantitativa en tiempo real y el análisis de microRNA. Esperamos que nuestra presentación contribuya a completar con éxito estos análisis.
En primer lugar, colocar las células cultivadas en un matraz adecuado suficiente para la extracción de ARN y proteínas, para realizar la expresión génica mediante el análisis de qPCR o micro array. Luego incubar durante la noche con medios complementados con 10 por ciento de FBS y 1 por ciento de estreptomicina de penicilina. Al día siguiente, preparar la muestra de microRNA para la transfección diluyendo microRNA 143 y microRNA 506 en medios a una concentración de 100 nanomolares cada uno.
Saque el matraz de la incubadora y retire el soporte. Lavar con 1x PBS. Todos los controles no tratados contendrán sólo medios incompletos con células.
Incubar las células con medios de transfección durante seis horas en una incubadora. Después de seis horas, retire el soporte y sustitúyalo por cuatro mililitros de medios frescos y completos. Cosecha las células después de 24 horas y 48 horas por tripsinación.
A continuación, lavar dos veces con 1x PBS en cada tubo y quitar el sobrenadante. Para realizar la extracción de ARN en un momento posterior, congele las células a menos 80 grados centígrados. La extracción de ARN se realizó utilizando un kit de ARN, siguiendo las instrucciones del fabricante.
En primer lugar, retire los tubos de menos 80 grados Centígrados y deje descongelar. Agregue 300 microlitros de tampón de lelisis y pipeta hacia arriba y hacia abajo para romper la membrana celular. Añadir el mismo volumen de etanol 100 por ciento ultrapura.
A continuación, mezcle bien y colóquelo en una columna separada. Centrifugar y quitar el flujo a través. Agregue 400 microlitros de lavado y tampón y centrífuga para retirar el tampón.
Añadir 5 microlitros de DNAse 1 con 75 microlitros Tampón de digestión VNA en cada muestra, e incubar durante 15 minutos. A continuación, lave la muestra con un tampón de preparación de ARN de 400 microlitrotros. A continuación, lave dos veces con el tampón de lavado de ARN.
Ahora, agregue agua sin nucleasas a la columna, centrífuga y luego recoja el ARN. Mida la concentración de ARN. En esta etapa, se pueden enviar dos microgramos de muestra de ARN para la secuenciación de ARN.
Preparar el ADNc de acuerdo con el protocolo descrito en la sección de texto, utilizando termociclador. Prepare soluciones de imprimación hacia delante y hacia atrás con agua libre de DNAse RNAse a una concentración de 10 micromolares. Preparar una mezcla maestra para cada gen que se detecte de acuerdo con el número de muestras.
Para cada muestra de ADNc, la cantidad de reacción es de acuerdo con la tabla descrita en el texto. Coloque cada muestra en sus respectivos pozos. Para qPCR, siempre es bueno preparar un documento de Excel con 96 diseño de placa de pozo, con el fin de realizar un seguimiento de las muestras.
Para cada muestra y gen analizado, realizar su reacción en triplicados, o al menos duplicados. Selle la placa de plástico con sellador de plástico transparente y ópticamente transparente. Evite tocar la fina capa de plástico con los dedos, ya que esto puede producir señal falsa.
Gire rápidamente la placa para mezclar todos los reactivos en la parte inferior de sus pozos. A continuación, ejecute la placa de muestra utilizando una máquina de PCR cuantitativa en tiempo real. Obtenga los valores de TC generados por la máquina qPCR y analice la expresión génica relativa.
Transfectar las células como se describe en la sección anterior de este video. Cosecha las células de cada muestra en tubos estériles separados de 15 mililitros para la trippsinación. A continuación, lave las células dos veces con 1x PBS, por centrifugación a 751G durante cinco minutos, y luego retire el sobrenadante.
Vuelva a suspender y romper la paleta añadiendo 200 microlitros fríos 1x PBS a través de una pipeta. Agregue dos mililitros de etanol helado al 70 por ciento, en el tubo, mientras que vórtice el tubo suavemente para fijar las células. Incubar los tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente y colocarlos en cuatro grados centígrados durante una hora.
Retire los tubos de cuatro grados centígrados y centrifugar. Añadir 2ml de PBS helado y vórtice, y luego quitar el sobrenadante por centrifugación. Añadir 500 microlitros de 1x PBS que contengan yoduro propidium y ribonucleasa A con concentración de 50 y 200 microgramos por mililitro, respectivamente, en cada muestra, e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Transfiera las muestras a los tubos apropiados, protegiendo de la luz, y funcione en el citómetro de flujo. Este experimento consiste en identificar todas las proteínas de la vía del ciclo celular que las proteínas cambiaron por el tratamiento del microRNA. Recoger muestras de proteínas de acuerdo con el procedimiento descrito en la sección de transfección, y cuantificar con el ensayo de BCA.
Retire los portaobjetos de menos cuatro grados centígrados una hora antes del experimento para llevar a temperatura ambiente y eliminar la humedad. Tome 70 microgramos de muestras de proteínas y prepare diapositivas de muestra de acuerdo con las instrucciones del fabricante, que también se describe paso a paso en la sección de texto. Aquí hay que tener en cuenta que el lavado adecuado de los toboganes con agua desionizada ultrapura es otro paso importante, ya que esto ayudará a reducir el fondo de los portaobjetos.
Además, es muy crítico en este experimento no secar las diapositivas de muestra hasta el paso final. Por último, escanee la diapositiva utilizando la máquina de micro-array y analice los datos. El análisis qPCR de las muestras tratadas con microARN tuvo lugar para determinar la expresión génica de CDK1, CDK4 y CDK6.
Estos genes regulan el ciclo celular de las células normales y cancerosas, y han sido dirigidos como un medio para inhibir la progresión tumoral. Los datos demostraron el efecto a la baja de estos genes debido al tratamiento con microRNA 143 y 506. Los datos de distribución del ciclo celular de la citometría de flujo demostraron un aumento de la población en la fase G0 y G1, y una disminución de la población en la fase S debido al efecto del tratamiento combinatoria de microRNA 143 y 506.
El análisis específico de micro-array del ciclo celular detectó cambios en la expresión de proteínas de aproximadamente 60 genes. El mapa de calor representado indicaba la regulación descendente a nivel proteico de múltiples genes necesarios para la progresión del ciclo celular y la proliferación, como CDK2, Helen 1 y 3, RE2F1. Por el contrario, las proteínas comúnmente reconocidas por su efecto inhibitorio cultivado fueron reguladas.
Aunque los resultados son semicuantitativos y se requiere un análisis adicional, el análisis de micro-array proporciona una visión general rápida de la actividad de la vía. Creemos que, después de ver este video, usted será capaz de realizar experimentos de laboratorio fundamentales, así como complejos, que le ayudarán en la identificación de la actividad de microARN en las células.
