Questo metodo aiuterà a comprendere ed eseguire le tecniche di laboratorio necessarie per identificare l'attività di due microRNA nelle cellule tumorali polmonari in vitro. Il cancro ai polmoni è la principale causa di morte correlata al cancro in tutto il mondo. Qui presentiamo tecniche che vanno dalle metodologie di laboratorio di base ai protocolli più complessi, come l'analisi dell'espressione genica e il microRNA proteico anticorpale, specificamente utilizzati per identificare l'effetto delle azioni del microRNA.
I seguenti metodi ci aiuteranno a rispondere a domande chiave riguardanti l'effetto di due microRNA, microRNA 143 e microRNA 506, sulla regolazione del ciclo cellulare nelle cellule tumorali polmonari. Presentiamo diverse tecniche di laboratorio, come la trasfezione cellulare, l'estrazione di RNA, l'analisi quantitativa in tempo reale pcr e microRNA. Speriamo che la nostra presentazione contribuisca a completare con successo queste analisi.
In primo luogo, seduti le cellule coltivate in un pallone appropriato sufficiente per l'estrazione di RNA e proteine, per eseguire l'espressione genica utilizzando qPCR o analisi micro-array. Quindi incubare durante la notte con supporti integrati con 10 per cento FBS e 1 per cento di streptomicina penicillina. Il giorno successivo, preparare il campione di microRNA per la trasfezione diluire il microRNA 143 e il microRNA 506 in media ad una concentrazione di 100 nanomolari ciascuno.
Esenzi il pallone dall'incubatore e rimuovi il supporto. Lavare con 1x PBS. Tutti i controlli non trattati conterranno solo supporti incompleti con celle.
Incubare le cellule con mezzi di trasfezione per sei ore in un'incubatrice. Dopo sei ore, rimuovere il supporto e sostituirlo con quattro millilitri di supporti freschi e completi. Raccogliere le cellule dopo 24 ore e 48 ore per tripsicinazione.
Quindi, lavare due volte con 1x PBS in ogni tubo e rimuovere il supernatante. Per eseguire l'estrazione dell'RNA in un secondo momento, congelare le cellule a meno 80 gradi Celsius. L'estrazione dell'RNA è stata eseguita utilizzando un kit di RNA, seguendo le istruzioni del produttore.
In primo luogo, rimuovere i tubi da meno 80 gradi Celsius e lasciare scongelare. Aggiungere 300 microlitri di tampone dilisi e pipetta su e giù per rompere la membrana cellulare. Aggiungere lo stesso volume di etanolo ultra puro al 100%.
Quindi mescolare bene e posizionare in colonna separata. Centrifugare e rimuovere il flusso. Aggiungere 400 microlitri di lavaggio e tampone e centrifuga per rimuovere il tampone.
Aggiungere 5 microlitri di DNAsi 1 con 75 microlitri VNA buffer di digestione in ogni campione e incubare per 15 minuti. Quindi lavare il campione con tampone di preparazione dell'RNA a 400 microliter. Quindi, lavare due volte con tampone di lavaggio dell'RNA.
Ora, aggiungi acqua priva di nucleasi alla colonna, centrifuga e poi raccogli l'RNA. Misurare la concentrazione di RNA. In questa fase, due microgrammi di campione di RNA possono essere inviati per il sequenziamento dell'RNA.
Preparare il cDNA secondo il protocollo descritto nella sezione di testo, utilizzando il termociclo. Preparare soluzioni primer in avanti e in retromarcia con acqua priva di RNAse DNAse a una concentrazione di 10 micromolari. Preparare un master mix per ogni gene da rilevare in base al numero di campioni.
Per ogni campione di cDNA, la quantità di reazione è in base alla tabella descritta nel testo. Posizionare ogni campione nei rispettivi pozzi. Per qPCR, è sempre bene preparare un documento Excel con 96 layout di piastra di pozzo, al fine di tenere traccia dei campioni.
Per ogni campione e gene analizzato, eseguire la loro reazione in triplicati, o almeno duplicati. Sigillare la piastra di plastica con sigillare in plastica trasparente e otticamente trasparente. Evitare di toccare il sottile strato di plastica con le dita, in quanto ciò può produrre un segnale falso.
Ruotare rapidamente la piastra per mescolare tutti i reagenti sul fondo dei loro pozzi. Quindi, eseguire la piastra campione utilizzando una macchina PCR quantitativa in tempo reale. Ottenere i valori CT generati dalla macchina qPCR e analizzare per l'espressione genica relativa.
Trasfetto le celle come descritto nella sezione precedente di questo video. Raccogliere le cellule da ciascun campione in tubi sterili separati da 15 millilitri per la trippsinizzazione. Quindi, lavare le cellule due volte con 1x PBS, centrifugando a 751G per cinque minuti, quindi rimuovere il supernatante.
Sospendere e rompere la tavolozza aggiungendo 200 microliter ghiacciati 1x PBS attraverso una pipetta. Aggiungere due millilitri di etanolo ghiacciato al 70%, per quanto riguarda la goccia al tubo, mentre si vortice delicatamente il tubo per fissare le cellule. Incubare i tubi per 30 minuti a temperatura ambiente e metterli in quattro gradi Celsius per un'ora.
Rimuovere i tubi da quattro gradi Celsius e centrifuga. Aggiungere PBS e vortice ghiacciati da 2 ml, quindi rimuovere il supernatante mediante centrifugazione. Aggiungere 500 microlitri di 1x PBS contenenti propidioduro e ribonucleasi A con concentrazione rispettivamente di 50 e 200 microgrammi per millilitro in ciascun campione e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Trasferire campioni in tubi appropriati, proteggendosi dalla luce, ed eseguire su citometro di flusso. Questo esperimento è quello di identificare tutta l'espressione delle proteine della via del ciclo cellulare cambiata dal trattamento con microRNA. Raccogliere campioni proteici secondo la procedura descritta nella sezione di trasfezione e quantificare con il saggio BCA.
Rimuovere le diapositive da meno quattro gradi Celsius un'ora prima dell'esperimento per portare a temperatura ambiente e rimuovere l'umidità. Prelevare 70 microgrammi di campioni proteici e preparare diapositive campione secondo le istruzioni del produttore, che è anche descritto passo dopo passo nella sezione di testo. Qui da notare, un corretto lavaggio degli scivoli con acqua deionizzata ultra pura è un altro passo importante, in quanto ciò aiuterà a ridurre lo sfondo delle diapositive.
Inoltre, è molto critico in questo esperimento non asciugare le diapositive campione fino al passaggio finale. Infine, scansionare la diapositiva utilizzando la macchina micro-array e analizzare i dati. L'analisi qPCR dei campioni trattati con microRNA ha avuto luogo per determinare l'espressione genica di CDK1, CDK4 e CDK6.
Questi geni regolano il ciclo cellulare delle cellule normali e tumorali, e sono stati presi di mira come mezzo per inibire la progressione tumorale. I dati hanno dimostrato l'effetto downregolatorio di questi geni dovuto al trattamento con microRNA 143 e 506. I dati sulla distribuzione del ciclo cellulare dalla citometria del flusso hanno dimostrato un aumento della popolazione nella fase G0 e G1 e una diminuzione della popolazione nella fase S a causa dell'effetto del trattamento combinatorio del microRNA 143 e 506.
L'analisi specifica del micro-array del ciclo cellulare ha rilevato cambiamenti di espressione proteica di circa 60 geni. La mappa termica rappresentata indicava la downregolazione a livello proteico di più geni necessari per la progressione del ciclo cellulare e la proliferazione, come CDK2, Helen 1 e 3, RE2F1. Al contrario, le proteine comunemente riconosciute dal loro effetto inibitorio adulto sono state upregolamentate.
Sebbene i risultati siano semi-quantitativi e siano necessarie ulteriori analisi, l'analisi dei micro-array fornisce una rapida panoramica dell'attività del percorso. Crediamo che, dopo aver visto questo video, sarai in grado di eseguire sperimentazioni di laboratorio fondamentali, oltre che complesse, che ti aiuteranno nell'identificazione dell'attività del microRNA nelle cellule.
