Этот метод поможет понять и выполнить лабораторные методы, необходимые для выявления активности двух микроРНК в раковых клетках легких in vitro. Рак легких является основной причиной смерти, связанной с раком во всем мире. Здесь мы представляем методы, охватывающие от базовых лабораторных методологий до более сложных протоколов, таких как анализ экспрессии генов и микроРНК белка антител, специально используемые для определения влияния действий микроРНК.
Следующие методы помогут нам ответить на ключевые вопросы, касающиеся влияния двух микроРНК, микроРНК 143 и микроРНК 506, на регулирование клеточного цикла в раковых клетках легких. Мы представляем различные лабораторные методы, такие как трансфекция клеток, экстракция РНК, количественный анализ ПЦР в реальном времени и микроРНК. Мы надеемся, что наша презентация будет способствовать успешного завершения этих анализов.
Во-первых, место культурных клеток в соответствующей колбе достаточно для извлечения РНК и белка, для выполнения экспрессии генов с помощью qPCR или микро-array анализа. Затем инкубировать на ночь со средствами массовой информации дополняется 10 процентов FBS и 1 процент пенициллина стрептомицин. На следующий день подготовь образец микроРНК для трансфекции путем разбавления микроРНК 143 и микроРНК 506 в средствах массовой информации в концентрации 100 наномолярных каждый.
Вынюхив колбу из инкубатора и удалите средства массовой информации. Вымойте с 1x PBS. Все необработанные элементы управления будут содержать только неполные средства массовой информации с ячейками.
Инкубировать клетки с трансфекции средств массовой информации в течение шести часов в инкубаторе. Через шесть часов удалите мультимедиа и замените четыре миллилитров свежих, полных средств массовой информации. Урожай клеток после 24 часов и 48 часов путем трипсинизации.
Далее, мыть дважды с 1x PBS в каждой трубке и удалить супернатант. Для того, чтобы выполнить экстракции РНК в более позднее время, заморозить клетки при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Добыча РНК была выполнена с использованием РНК-комплекта, следуя инструкциям производителя.
Во-первых, удалите трубки от минус 80 градусов по Цельсию и дайте оттаять. Добавьте 300 микролитров буфера лиза и пипетки вверх и вниз, чтобы сломать клеточную мембрану. Добавьте равный объем 100-процентного ультра-чистого этанола.
Затем хорошо перемешать и поместить в разделенную колонку. Центрифуга и удалить поток через. Добавьте 400 микролитров стирки и буфера и центрифуги, чтобы удалить буфер.
Добавьте 5 микролитров DNAse 1 с буфером пищеварения 75 микролитров VNA в каждом образце и инкубировать в течение 15 минут. Затем мыть образец с 400 микролитер РНК подготовительный буфер. Далее, мыть дважды с РНК мыть буфер.
Теперь добавьте воду без нуклеазы в колонку, центрифугу, а затем соберите РНК. Измерьте концентрацию РНК. На этом этапе два микрограмма образца РНК могут быть отправлены для секвенирования РНК.
Подготовь cDNA в соответствии с протоколом, описанным в текстовом разделе, с помощью термоциклера. Подготовка вперед и обратной грунтовка решений с DNAse RNAse свободной воды в концентрации 10 микромоляров. Подготовь мастер-микс для каждого гена, который будет обнаружен в зависимости от количества образцов.
Для каждого образца cDNA количество реакции в соответствии с таблицей, описанной в тексте. Поместите каждый образец в соответствующие скважины. Для qPCR, это всегда хорошо, чтобы подготовить документ Excel с 96 хорошо макет пластины, для того, чтобы отслеживать образцы.
Для каждого образца и проанализированного гена, выполнять их реакцию в три раза, или по крайней мере дубликаты. Печать пластиковой пластины с прозрачным, оптически прозрачным пластиковым уплотнитель. Избегайте прикосновения к тонкому пластиковому слою пальцами, так как это может привести к ложному сигналу.
Быстро спина пластины смешать все реагенты на дно своих скважин. Затем запустите выборку пластины с помощью количественной, в режиме реального времени ПЦР машины. Получите значения КТ, генерируемые машиной qPCR, и проанализируйте для относительной экспрессии генов.
Transfect клетки, как описано в предыдущем разделе этого видео. Урожай клеток из каждого образца в отдельных, 15 миллилитров стерильных труб для трипсинизации. Затем, мыть клетки дважды с 1x PBS, путем центрифугации на 751G в течение пяти минут, а затем удалить супернатант.
Повторно приостановить и разорвать палитру, добавив 200 микролитер ледяной 1x PBS через пипетки. Добавьте два миллилитров 70-процентного ледяного этанола, по капле в трубку, при этом аккуратно вихревая трубка, чтобы исправить клетки. Инкубировать трубки в течение 30 минут при комнатной температуре и поместить их в четыре градуса по Цельсию в течение одного часа.
Удалите трубки с четырех градусов по Цельсию и центрифугу. Добавьте 2 мл ледяного PBS и вихря, а затем удалите супернатант центрифугой. Добавьте 500 микролитров 1x PBS, содержащих йодидный и рибонуклеазу А с концентрацией 50 и 200 микрограммов на миллилитр, соответственно, в каждом образце и инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре.
Перенесите образцы в соответствующие трубки, защищая от света, и бегите по потоку цитометра. Этот эксперимент заключается в выявлении всех белков клеточного цикла пути изменены микроРНК лечения. Сбор образцов белка в соответствии с процедурой, описанной в разделе трансфекции, и количественно с анализом BCA.
Удалите горки с минус четырех градусов по Цельсию за час до эксперимента, чтобы довести до комнатной температуры и удалить влагу. Возьмите 70 микрограмм образцов белка и подготовьте образцы слайдов в соответствии с инструкциями производителя, которые также описаны шаг за шагом в текстовом разделе. Здесь следует отметить, что правильное мытье горок с ультра-чистой деионизированной водой является еще одним важным шагом, так как это поможет уменьшить фон слайдов.
Кроме того, очень важно в этом эксперименте не высыхать слайды образца до последнего шага. Наконец, сканируйте слайд с помощью микро-машины и анализируйте данные. Для определения экспрессии генов CDK1, CDK4 и CDK6 был проведен анализ микроРНК-обработанных образцов.
Эти гены регулируют клеточный цикл нормальных и раковых клеток, и были направлены в качестве средства для ингибирования прогрессирования опухоли. Данные продемонстрировали downregulatory влияние этих генов из-за лечения микроРНК 143 и 506. Данные о распределении клеточного цикла из цитометрии потока продемонстрировали увеличение популяции в фазе G0 и G1, а также уменьшение популяции в фазе S из-за эффекта комбинаторного лечения микроРНК 143 и 506.
Специфический микро-array анализ цикла клетки обнаружил изменения выражения протеина приблизительно 60 генов. Представленная тепловая карта указывает на низкорегуляцию на уровне белка нескольких генов, необходимых для прогрессирования клеточного цикла и пролиферации, таких как CDK2, Helen 1 и 3, RE2F1. В отличие от этого, белки, широко признанные их выросли ингибирующее действие были upregulated.
Несмотря на то, что результаты являются полуколичеводческих и требуется дальнейший анализ, анализ микро массива обеспечивает краткий обзор деятельности пути. Мы считаем, что после просмотра этого видео, вы сможете выполнить фундаментальные, а также сложные, лабораторные эксперименты, которые помогут вам в выявлении активности микроРНК в клетках.
