Este método ajudará a entender e executar técnicas de laboratório necessárias para identificar a atividade de dois microRNA em células cancerígenas de pulmão in vitro. O câncer de pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. Aqui, apresentamos técnicas que abrangem desde metodologias básicas de laboratório até protocolos mais complexos, como análise de expressão genética e microRNA de proteína de anticorpos, especificamente utilizados para identificar o efeito das ações do microRNA.
Os seguintes métodos nos ajudarão a responder a perguntas-chave sobre o efeito de dois microRNAs, microRNA 143 e microRNA 506, sobre a regulação do ciclo celular em células cancerígenas de pulmão. Apresentamos diferentes técnicas de laboratório, como transfecção celular, extração de RNA, análise quantitativa de PCR em tempo real e microRNA. Esperamos que nossa apresentação contribua para concluir com sucesso essas análises.
Primeiro, acomodar as células cultivadas em um frasco apropriado suficiente para extração de RNA e proteína, para realizar a expressão genética usando qPCR ou análise de micro array. Em seguida, incubar durante a noite com mídia suplementada com 10% de FBS e 1% de estreptomicina de penicilina. No dia seguinte, prepare a amostra de microRNA para transfecção diluindo o microRNA 143 e o microRNA 506 em mídia a uma concentração de 100 nanomolar cada.
Tire o frasco da incubadora e remova a mídia. Lave com 1x PBS. Todos os controles não tratados conterão apenas mídia incompleta com células.
Incubar as células com mídia de transfecção por seis horas em uma incubadora. Após seis horas, remova a mídia e substitua por quatro mililitros de mídia fresca e completa. Colher as células após 24 horas e 48 horas por experimentação.
Em seguida, lave duas vezes com 1x PBS em cada tubo e remova o supernasciente. A fim de realizar a extração de RNA mais tarde, congele as células a menos 80 graus Celsius. A extração de RNA foi realizada utilizando-se um kit RNA, seguindo as instruções do fabricante.
Primeiro, remova os tubos de menos 80 graus Celsius e deixe descongelar. Adicione 300 microliters de tampão de lise e pipeta para cima e para baixo para quebrar a membrana celular. Adicione o mesmo volume de 100% de etanol ultra-puro.
Em seguida, misture bem e coloque em coluna separada. Centrifugar e remover o fluxo. Adicione 400 microliters de lavagem e tampão e centrífuga para remover o buffer.
Adicione 5 microliters de DNAse 1 com 75 microliters VNA tampão de digestão em cada amostra e incubar por 15 minutos. Em seguida, lave a amostra com 400 tampão de preparação de RNA microliter. Em seguida, lave duas vezes com tampão de lavagem de RNA.
Agora, adicione água sem nuclease à coluna, centrífuga e, em seguida, colete o RNA. Meça a concentração de RNA. Nesta fase, dois microgramas de amostra de RNA podem ser enviados para o sequenciamento de RNA.
Prepare o cDNA de acordo com o protocolo descrito na seção texto, usando termociclador. Prepare soluções de primer para frente e invertida com água livre de DNAse RNAse para uma concentração de 10 micromolar. Prepare uma mistura mestra para que cada gene seja detectado de acordo com o número de amostras.
Para cada amostra de cDNA, a quantidade de reação é de acordo com a tabela descrita no texto. Coloque cada amostra em seus respectivos poços. Para qPCR, é sempre bom preparar um documento Excel com layout de placa de 96 poços, a fim de acompanhar as amostras.
Para cada amostra e gene analisado, realize sua reação em triplicados, ou pelo menos duplicados. Sele a placa de plástico com um selador plástico transparente e opticamente transparente. Evite tocar na fina camada plástica com os dedos, pois isso pode produzir sinal falso.
Gire rapidamente a placa para misturar todos os reagentes ao fundo de seus poços. Em seguida, execute a placa de amostra usando uma máquina PCR quantitativa em tempo real. Obtenha os valores de TC gerados pela máquina qPCR e analise para a expressão genética relativa.
Transfeito as células como descrito na seção anterior deste vídeo. Células de colheita de cada amostra em tubos estéreis separados de 15 mililitros para trippsinização. Em seguida, lave as células duas vezes com 1x PBS, por centrifugação a 751G por cinco minutos, e depois remova o supernante.
Suspenda e quebre a paleta adicionando 200 microliter gelado 1x PBS através de uma pipeta. Adicione dois mililitros de 70% de etanol gelado, em termos de gota ao tubo, enquanto o vórtice do tubo suavemente para consertar as células. Incubar tubos por 30 minutos em temperatura ambiente e colocá-los em quatro graus Celsius por uma hora.
Remova os tubos de quatro graus Celsius e centrífuga. Adicione 2ml de PBS gelado e vórtice e, em seguida, remova o sobrenatante por centrifugação. Adicione 500 microliters de 1x PBS contendo iodeto de propídio e ribonuclease A com concentração de 50 e 200 microgramas por mililitro, respectivamente, em cada amostra, e incubar por 30 minutos à temperatura ambiente.
Transfira amostras para tubos apropriados, protegendo da luz e execute em citômetro de fluxo. Este experimento é identificar toda a expressão das proteínas da via do ciclo celular alterada pelo tratamento microRNA. Coletar amostras de proteína de acordo com o procedimento descrito na seção de transfecção e quantificar com o ensaio BCA.
Remova os slides de menos quatro graus Celsius uma hora antes do experimento para trazer à temperatura ambiente e remover a umidade. Pegue 70 microgramas de amostras de proteínas e prepare slides de amostra de acordo com as instruções do fabricante, que também é descrito passo a passo na seção de texto. Aqui para notar, a lavagem adequada de lâminas com água deionizada ultra-pura é outro passo importante, pois isso ajudará a reduzir o fundo dos slides.
Além disso, é muito crítico neste experimento não secar os slides da amostra até a etapa final. Finalmente, escaneie o slide usando a máquina de micro array e analise os dados. A análise qPCR das amostras tratadas com microRNA ocorreu para determinar a expressão genética de CDK1, CDK4 e CDK6.
Esses genes regulam o ciclo celular de células normais e cancerosas, e têm sido alvo como um meio de inibir a progressão do tumor. Os dados demonstraram o efeito de baixa regulação desses genes devido ao tratamento com microRNA 143 e 506. Os dados de distribuição do ciclo celular da citometria de fluxo demonstraram um aumento populacional na fase G0 e G1, e uma diminuição populacional na fase S devido ao efeito do tratamento combinatório do microRNA 143 e 506.
A análise específica de micro array do ciclo celular detectou alterações na expressão proteica de aproximadamente 60 genes. O mapa de calor representado indicou a baixa regulação no nível proteico de múltiplos genes necessários para a progressão do ciclo celular e proliferação, como CDK2, Helen 1 e 3, RE2F1. Em contraste, as proteínas comumente reconhecidas pelo seu efeito inibidor crescido foram reguladas.
Embora os resultados sejam semi-quantitativos e uma análise mais aprofundada seja necessária, a análise de micro array fornece uma visão geral rápida da atividade da via. Acreditamos que, depois de assistir a este vídeo, você será capaz de realizar experimentações de laboratório fundamentais, bem complexas, que irão ajudá-lo na identificação da atividade de microRNA nas células.
