RpdA gibi Sınıf 1 histone deasetilazlar mantar enfeksiyonlarının tedavisinde potansiyel yeni hedefler olarak tartışılmaktadır. Ancak, saflaştırılmış enzim aktiviteleri daha fazla karakterizasyon için gereklidir. Bu protokolün en büyük avantajı, tek bir adımda etkinlik belirleme için yerli TAP etiketli komplekslerin hızlı ve yeterli ayrılmasıdır.
Bu protokolden türetilen HDAC kompleksleri, yeni mantara özgü deactylase inhibitörlerinin etkinlik gösterimi için kullanılabilir. Bu yöntem, diğer enzimler ve suşlar için protokollerin oluşturulmasında başlangıç noktası olarak kullanılabilecek TAP etiketli mantar proteinlerinin çıkarılması ve saflaştırılması için temel oluşturur. Bu yordamı başlatmak için, hazırlanan konidia her şişe için CSS 10 mililitre ekleyin.
Sıkıca sağlanan vida kapağı ile her şişe kapatın ve şiddetle sallayın. Bundan sonra, kalan konidiayı tamamen kazımak için steril bir aşılama döngüsü kullanın. Konidiyayı bir santrifüj tüpüne yerleştirilen 40 mikrometrelik hücresüzeğeğin içinden geçirin ve şişelerin beşinden süspansiyonu tek bir tüpe alın.
Daha sonra örnekleri birleştirmek ve metin protokolünde belirtildiği gibi örnekleri seyreltmek için santrifüj. Bir şişenin üstündeki huniye peynir bezi yerleştirin. Hazırlanan miseli bezin içinden süzün ve deiyonize su ile kısa bir süre yıkayın.
Peynir bezini sadece eller arasında ve kağıt havluların arasına sıkıştırarak miselden mümkün olduğunca fazla nemi çıkarın. Bundan sonra, bir vida kapağı ile plastik bir beher içine düz levhalar olarak kurutulmuş misel aktarın. Sıvı nitrojen kullanarak miseli flaş dondurun ve liyofilizleşmeden önce eksi 80 derecede saklayın.
Sonra bir gecede miseli lyophilize. Ertesi gün, misel sıcaklığı sabit kaldığında donma işlemini durdurun. Gagaları çıkarın ve hemen sağlanan vida kapakları ile mühürleyin.
İlk misel 1.5 gram ve bir top değirmen taşlama kavanozuna bir taşlama topu ekleyin. Misel tozunu 25 hertz'de 30 saniye boyunca öğütün ve misel tozunu 15 mililitrelik santrifüj tüpüne aktarın. Miselin tamponla daha sonra karıştırılmasını sağlamak için tüpü yatırın, ardından 1X proteaz inhibitörü kokteyli de dahil olmak üzere altı mililitre buz gibi ekstraksiyon tamponu B250 ekleyin ve ham ekstresin tam homojenizasyonu elde edilene kadar küçük bir spatula ile karıştırın;tüpü beş dakika boyunca buzüzerinde tutun.
Sonraki yer tüp ve bir denge tüpü bir santrifüj içine ve spin 40, 000 kez g ve en az 20 dakika boyunca dört derece santigrat. Santrifüj sırasında, IgG reçinesini dengelemeye başlamak için 10 mililitrelik tek kullanımlık kromatografi sütunu ortaya çıkardı. Pipet 300 mikrolitre iyi yeniden askıda IgG reçine sütuniçine.
B250 ile 10 mililitre sütun doldurun ve arabellek yerçekimi ile akmasını sağlar. 1X proteaz inhibitör kokteyl de dahil olmak üzere B250 bir mililitre ekleyin ve üzerinden akmasına izin, sonra sütunun alt fiş. Santrifüjden sonra, SDS-PAGE analizi için süpernatantın 10 mikrolitresini çıkarın.
Numuneyi 40 mikrolitre su ve 12,5 mikrolitre 5X LSB içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Serolojik pipet kullanarak, supernatant dikkatle çıkarın ve dengede IgG boncuk içeren sütun üzerine aktarın. Sağlanan uç kapağı sıkıca emniyete alarak sütunu kapatın.
Başlamak için, kromatografi sütununa 10 rpm'de ve dört santigrat derecede iki ila dört saat boyunca bir döner mikser üzerinde kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kapağı çıkarın ve akış-through toplamak için alt sütunu açın. Sütunu yıkamak için, sütun kapağına bir mililitre yıkama tamponu 250 eklemek için bir pipetter kullanın ve bu süspansiyonu bir floşla kaplanmış reçineye aktarın ve boncukları yeniden askıya alın.
Daha sonra üst tampon 250 yıkama ile üst sütun doldurun ve peristaltik pompa bağlı bir yığın kapağı kullanarak kapatın. Peristaltik pompayı çalıştırın ve pompayı dakikada yaklaşık 1-5 mililitre akış hızına ayarlayın, bu yıkama işlemini toplam dört yıkama için tekrarlayın, ardından TEV denge tamponu kullanarak bu yıkama işlemini üç kez tekrarlayın. Alttaki kromatografi sütununa kapatın.
TEV dekolte tampon bir mililitre IgG boncuk resuspend ve 50X proteaz inhibitör kokteyl 20 mikrolitre yanı sıra TEV 10 mikrolitre ekleyin. Sonraki kapak sütun ve etiketli HDAC ile bağlı protein kompleksleri aşmak için bir gecede 10 rpm ve dört derece santigrat bir döner karıştırıcı üzerinde kuluçka. Ertesi gün, sütunaçın açın ve iki mililitrelik bir santrifüj tüp içinde eluate toplamak.
Boncukları kapaktan çıkarmak ve sütunun duvarını durulamak için 0,7 mililitre TEV dekolte tamponu kullanın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüp içine iki mililitrelik centrifuge tüp yerleştirin ve sonra açık iki mililitrelik tüp üzerine sütun yerleştirin. TEV eluate elde etmek için iki dakika boyunca 300 kez g bir masa santrifüj üzerine tüm montaj aktarın ve spin.
Bu çalışmada, in vitro deactylaz aktivitesinin değerlendirilmesi için filamentöz mantar Aspergillus nidulans bir TAP etiketli Sınıf 1 HDAC tek adımzenginleştirme yapılır. Bunun tipik bir sonucu, tandem arınma gerçekleştirirken daha da artmıştır ilk yakınlık adım, etkinliğini göstermektedir. Protein ekstresinde ve akışta bulunan belirgin proteinlerin çoğu, ancak, zaten TEV eluate tükenmiş.
Bir immünoblot tev eluate CBP etiketli tam uzunlukta RpdA karşılık gelen yaklaşık 120 kilodaltons göç güçlü sinyaller gösterir, calmodulin akışı-through, ve kesirler eluate. Özel HDAC inhibitörü Trichostatin A ile temsili bir deaktik aktivite teşbiburada gösterilmiştir. Aktivitenin duyarlılığı ölçülen değerlerin RpdA'dan kaynaklandığını ve spesifik olmayan proteaz aktivitesinden kaynaklanmadığını doğrular.
Bu, oldukça yüksek konsantrasyonda bulunan TEV proteazın HDAC aktivitesi tsözünde etkili olmadığını gösterdiği için önemlidir. İlginçtir, HDAC aktivitesi önemli ölçüde tev eluate ile karşılaştırıldığında, ikinci yakınlık arınma adımı, CE, sonra azalır. Verimli protein ekstraksiyonu sağlamak için miselinince toz haline getirmek için zeminden emin olun.
Bu özellikle makine olmadığında ve taşlama için harç ve havaneli kullanıldığında önemlidir. Protokole ikinci yakınlık adımının eklenmesi, protein tanımlaması için yeterli saf kesirlerle sonuçlanır ancak kütle spektrometresi üzerinde yapılır. Sıvı nitrojen ile çalışırken, kişisel yaralanmaları önlemek için güvenlik gözlüğü ve koruyucu eldiven giymek emin olun.
