Hücre tedavilerine olan ilginin artmasıyla birlikte, bu hücrelerin işlevselliğini değerlendirmek için yeni yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu protokol, bu hücre engraftasyonunun nöral bağlamda in vitro uzun vadeli değerlendirmesine izin verir. Bu tekniğin temel avantajları, tüm bileşenlerin insan kaynaklı olmasıdır.
Ayrıca, aşılama kolayca izlenebilir ve organoidden gelen ortam kolayca değiştirilebilir, bu da farklı ilaçların veya tedavilerin test edilmesine izin verir. Bu tekniği göstermek, laboratuvarımda yetenekli bir doktora öğrencisi olan Iliana Ibanez olacak. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin veya iPSC'den türetilmiş nöral progenitör hücrelerin veya NPC'lerin tek hücreli süspansiyonunu buzdan çıkararak ve bunları 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 300 g'da santrifüjleyerek başlayın.
Süpernatanı çıkarın ve enjeksiyon başına iki mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için hücre peletini mililitre çözünmüş bazal membran matrisi başına 3 miligramda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu kullanana kadar hemen buzun üzerine yerleştirin. Önceden soğutulmuş şırıngayı daha sonra kullanmak üzere 20 santigrat derece dondurucudan bir buz kovasına aktarın.
Daha sonra, beyin organoid plakasını inkübatörden çıkarın ve organoidi geniş çaplı bir uç kullanarak 35 milimetrelik bir tabağa aktarın. Organoidleri stabilize etmek ve enjeksiyonu kolaylaştırmak için, organoide zarar vermeden ortamı mümkün olduğunca çıkarın. Enjeksiyonu kolaylaştırmak için organoidi içeren 35 milimetrelik çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
Organoidler enjekte edilmeye hazır olduğunda, soğutulmuş bir P20 pipet ucu kullanarak EGFP etiketli NPC hücrelerini nazikçe yeniden süspanse edin ve bu hücrelerin iki mikrolitresini önceden soğutulmuş steril bir cam slayt üzerine taşıyın. Buzdan önceden doldurulmuş bir insülin şırıngası alın ve iğnenin eğimi aşağı bakacak şekilde 2 mikrolitre hücre süspansiyonunu yavaşça yukarı çekin. Mikroskobu üzerine odaklamadan önce organoid içeren tabağın kapağını açın.
Çanağı bir elinizle tutun, iğnenin eğimini yukarı yerleştirin. Öte yandan, hücreyi yavaşça organoid yüzeye enjekte edin. Hücreleri enjekte ettikten sonra, kapağı tekrar tabağa yerleştirin ve enjekte edilen organoidi bir ila iki dakika inkübe edin.
Ardından, organoidi geniş delikli bir uca sahip 24 oyuklu bir plakaya aktarmadan önce plakaya 500 mikrolitre organoid ortam ekleyin. Organoidi 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte her iki günde bir tam bir ortam değişikliği ile inkübe edin. Floresan mikroskobuna enjekte edilmemiş veya negatif kontrol organoidi yükleyin.
Minimum otomatik floresan için aydınlatma yoğunluğunu 1 ile 2 arasında ve pozlama süresini 80 ile 100 milisaniye arasında ayarlayın. Ardından, pozitif kontrol organoidini yükleyin ve etiketli hücrelerin görünür olduğundan emin olmak için maruz kalma süresini artırın. Enjeksiyon için geliştirilmiş yeşil floresan proteini veya EGFP plus bölgesini bulmak için organoidi geniş çaplı bir pipet ucuyla yeniden konumlandırın.
Organoidi yüklemeden önce ortamı organoidden tamamen çıkarın. Ve seçilen ayarlarla görüntüleyin. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, organoidin kurumasını önlemek için hemen yeni bir ortam ekleyin.
Tüm organoidler için besiyeri çıkarma ve görüntülemeyi tekrarladıktan sonra, organoidleri normal inkübasyona ve besiyeri değişikliklerine döndürün. Görüntülemeyi istediğiniz aralıklarla tekrarlayın. Slaytı iki dakika boyunca toluen ile doldurulmuş bir Coplin slayt boyama kavanozuna yerleştirin ve bu adımı tekrarlayın.
Ardından, cam slaytı iki dakika boyunca %100 etil alkolle doldurulmuş bir cam Coplin slayt boyama kavanozuna aktarın. Slaytı iki dakika boyunca suyla dolu bir Coplin kavanozuna aktarmadan önce bu adımı tekrarlayın. Yıkamayı suyla tekrarlayın.
Ardından, su banyosuna plastik bir kap yerleştirin ve plastiğin banyonun dibine temas etmemesini sağlayın. Sitrat tamponunu plastik kabın içine dökün ve 95 ila 100 santigrat dereceye ulaşmasına izin verin. Tampon istenen sıcaklığa ulaştığında, slaytları tamponun içine yerleştirin ve kabı bir kapakla gevşek bir şekilde kapatın ve slaytları su banyosunun içinde 30 ila 40 dakika bırakın.
İnkübasyondan sonra, plastik kabı su banyosundan çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika soğumaya bırakın. Slaytları PBS ile her biri iki dakika boyunca üç kez yıkayın. Numuneye dokunmadan PBS'yi bir kağıt mendille çıkarın.
Geçirgenlik tamponunu hazırlayın ve bir cam slayt boyama kavanozunu bununla doldurun. Slaytları geçirgenleştirme tamponuna daldırın ve 10 dakika inkübe edin. Her biri iki dakika boyunca üç PBS yıkamasını tekrarlayın.
Ardından, her bir numuneyi kaplayacak şekilde boyama karışımı hazırlayın ve slaytı oda sıcaklığında bir saat inkübe etmeden önce organoid slayda 25 mikrolitre ekleyin. İnkübasyondan sonra, her biri iki dakika boyunca üç PBS yıkamasını tekrarlayın ve slaytı bir cam slayt boyama kavanozu içinde damıtılmış suyla durulayarak tuzları çıkarın. Ardından, floresan mikroskobu kullanarak slaydı görüntülemeden önce her numuneye 10 mikrolitre sıvı yuvası ve DAPI ekleyin.
2X söndürme tamponu ile yarıya kadar doldurulmuş cam Coplin boyama kavanozuna 45 mililitre PBS ekleyin ve slaytları bu kavanozun içine yerleştirin. Kavanozu gece boyunca 4 santigrat derecede inkübe edin. Boyama ve görüntülemeyi tekrarlamadan önce floroforların etkili bir şekilde söndürülüp söndürülmediğini kontrol etmek için floresan mikroskobu kullanın.
10.000 hücre ve üzerinde tutarlı EGFP artı hücre yaması tespiti ile giriş hücresi sayısına GFP floresansının net bir doz bağımlılığı mevcuttu. EGFP pozitifliği için görüntülenen enjekte edilen organoidler ve kontroller, enjekte edilen bölgenin dört aylık izleme süresi boyunca kalıcılığını gösterdi. Ek EGFP pozitif hücre yamaları, transplantasyondan dokuz gün sonra ortaya çıktı ve çalışma bitiş noktasına kadar devam etti, bu da hücrelerin göçünü ve yeni bölgelerine entegrasyonunu gösterdi.
Daha yüksek bir büyütmede, organoide uzun çıkıntılarla net nöral morfoloji gözlemlenebildi ve enjekte edilen hücrelerin entegrasyonunu doğruladı. İlk tek tur boyama, NPC durumunu koruyan hücrelerin bir karışımı ve nöral bir kadere doğru farklılaşmış olanlar da dahil olmak üzere, enjeksiyon bölgesinde EGFP artı hücrelerin varlığını doğruladı. Kontrol ve enjekte edilen organoidler için, TUJ1 artı olgunlaşmamış olgun nöronların çoğunluğu ile çok az sayıda Nestin artı NPC gözlendi.
İki yuvarlak boyama daha fazla ayrıntı verdi ve organoidin dış bölgesinin çoğunun etrafındaki olgun nöronları ortaya çıkardı ve ortaya doğru olgunlaşmamış nöron alanları ortaya çıkardı. Astrositler, enjekte edilen ve kontrol organoidlerinde mevcuttu ve dış kenarların etrafına serpiştirildi. Enjekte edilen organoidde iki yuvarlak boyamanın gerçekleştirildiği dilim, olgun nöronların fenotipini benimsemiş olan enjeksiyon bölgesinden uzakta küçük bir EGFP artı hücre uydu kolonisi gösterdi.
Bu kolonilerin bazıları astrositlere yakın görünmektedir. Bununla birlikte, GFP boyamasıyla tam örtüşen hiçbir EGFP artı hücresi, astrositlerin kendilerini üretmekten ziyade bitişik olduklarını öne sürmedi. Organoidi enjekte ederken, organoidi tamamen yok edebileceğiniz için çok fazla kuvvet uygulamaktan veya çok hızlı yapmaktan kaçınmanız gerekir.
Bu nedenle, yaşam takibinden sonra, organoidler ilişkilendirilebilir ve akış sitometrisi analizi veya tek hücre dizileme yaklaşımları için kullanılabilir. Bu, hücrelerin moleküler durumunu bilmemizi sağlayacaktır. Bu teknik, nörodejeneratif hastalıklar için hücre tedavisini ilerletmek, ayrıca beyin tümörlerini veya metastazlarını modellemek için son derece yararlı olabilir.
