Rapamisin/mTOR etkileşimini incelemek için Yarı Kantitatif İlaç Affinity Responsive Target Stability (DARTS)

İlaç afinite duyarlı hedef kararlılık, DARTS, yeni küçük moleküllü protein hedeflerinin tespiti için sağlam bir yöntemdir. Bilinen küçük moleküllü protein etkileşimlerini doğrulamak ve doğal ürünler için potansiyel protein hedeflerini bulmak için kullanılabilir. Bu çalışmada, protein stabilitesindeki değişiklikleri izleyerek ve protein-ligand etkileşimlerinin yakınlığını tahmin ederek DARTS deneyinin veri analizi yeteneklerini daha da geliştiriyoruz.

Protein-ligand etkileşimleri iki eğri, bir proteolitik eğri ve doz bağımlılığı eğrisi karşı çizilebilir. MTOR-rapamycin etkileşimini protokolümüzün kurulması için örnek bir örnek olarak kullandık. %10 fetal sığır serumu, iki milimolar glutamin ve %1 antibiyotik içeren DMEM kullanarak 293T hücreleri büyütün.

Kültürleri %5 karbondioksit insantininin 37 derecede kuluçkaya yatırın. Kültür %80-90'lık birleştiğinde hücreleri soğuk PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri uygun miktarda soğuk hücre lisis tamponuna toplamak ve lysing hücrelerini 1,5 milimetrelik bir tüpe aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Lysis tamponve lysing hücreleri iyice karıştırmak ve 10 dakika boyunca buz üzerinde tüp kuluçka ters. Tüpü 18,000 kez g'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj edin. Supernatant'ı 1,5 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve buzüzerinde soğutulun.

Lysatların protein konsantrasyonu yaklaşık bca test gerçekleştirmek ve protein konsantrasyonu dayalı pronase seyreltme hesaplamak. İlk olarak, iki 1.5 mililitrelik tüpler, 99 mikrolitre her içine lysate aktarın. Lysate her aliquot için küçük moleküllü stok çözeltisi bir mikrolitre ekleyin ve sallayarak oda sıcaklığında 30 ila 60 dakika boyunca iki tüp kuluçka.

Buz üzerinde, 1x TNC taze çözülmüş pronase çözeltisi seri seyreltme kurmak. Küçük molekül ile kuluçka sonra, beş tüpler halinde örneklerin 20 mikrolitre içine her aliquot bölün. Aynı sindirim süresini sağlamak için, her 30 saniyede bir belirli aralıklarla, numunelere hazırlanan pronase çözeltilerinin iki mikrolitresini ekleyin.

Bir kontrol grubu için, Iki mikrolitre TNC arabelleği ekleyin. Beş ila 20 dakika sonra, 30 saniyelik aralıklarla soğuk 20x proteaz inhibitör kokteyl iki mikrolitre ilave yoluyla altı tüplerin sindirim durdurmak. İyibir şekilde karıştırın ve 10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.

Her numuneyi altı mikrolitre 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile seyreltin ve numuneleri 70 derecede 10 dakika kaynatın. Şimdi, Batı leke gerçekleştirmek için, uygun bir moleküler ağırlık belirteci ile birlikte, bir % 8 SDS-PAGE jel kuyularına protein eşit miktarda yükleyin. 80 volt 30 dakika jel çalıştırın, sonra 120 volt volta voltaj ı ayarlayın ve bir ila iki saat boyunca çalışmaya devam edin.

Küçük molekülün potansiyel hedef proteinlere doğrudan bağlanabilen ivedu. Bu protokolde, küçük molekül ile kuluçka proteoziz karşı koruma doğruladı. Üç bant araç kontrolü üzerinde rapamisin ile kuluçka ile korunduğu tespit edilebildi.

Batı lekeleme, düşük pronase ile protein oranlarında mTOR proteininin varlığını ve artan oranlarda azalma ve kaybını göstermiştir. Pronase tarafından mTOR proteolisisi açıkça rapamisin varlığı ile inhibe edildi ve rapamisin eklenmesi proteolitik eğribelirgin bir kayma üretti. Rapamisin doz-bağımlı mTOR düzeyini artırdı, rapamisin tedavisi ile mTOR artan istikrar düşündüren.

Hedef protein bandı yoğunluklarının ölçülmesi mTOR'un rapamisinin hedef proteini olduğunu göstermiştir. En iyi stepwise etkisi elde etmek için, bu deney protein oranları üzerinde pronase uygun bir dizi elde etmek için birkaç kez tekraredilmesi gerekebilir.