Optogenetik gibi optik yöntemler hücresel moleküler sinyallerin hassas modülasyonunu sağlayabilir. Protokolümüz hücresel sinyal molekülerlerinin femtosecond lazer stimülasyonu ile oral optik manipülasyonunu gösterdi. Femtosaniye lazerimizi konfokal mikroskoba dönüştürerek, tekniğimiz femtosecond lazer stimülasyon ve konfokal mikroskopi ile gerçek zamanlı, moleküler dinamik izleme ile tek hücreli veya hücre altı düzeyde operasyon sağlayabilir.
Bu yöntem herhangi bir floresan mikroskopi sistemlerine femtosecond lazeri uygun şekilde sisteme entegre ederek uygulanabilir. İlk kez bizim yöntem çalışıyor herkes için, lazer tesisinin ayrı talimatları izleyin veya bir laboratuvar femtosecond lazer kaynağı çalışırken profesyonellerden rehberlik isteyin. Başlamak için, femtosecond lazer ve konfokal mikroskobu açın.
Femtosecond lazer ışınını mekanik bir deklanşörden yönlendirmek için yansıtıcı aynalar kullanın. Daha sonra, iletim ışını genişliğini genişletmek için bir çift mercenden oluşan bir röle teleskopu ayarlayın. Bu, hedefin arka diyafram ile tutarlı olmalıdır.
Şimdi, genişletilmiş ışını mikroskoba hizalamak için yansıtıcı aynaları yönlendirin. Burada işaret edilen iki yansıtıcı aynayı ayarlayarak, femtosecond lazerin odak noktasını görüş alanının merkezine ayarlayın. Son olarak, lazerleri eşlik eden metin protokolünde açıklandığı şekilde ölçün ve ayarlayın.
Kültür Hela hücreleri standart teknikler kullanarak. Denemeyi gerçekleştirmeye hazır olduğunuzda, hücreleri eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi ERK2-GFP ile dönüştürün. Daha sonra, lazer tarama confocal mikroskop ve femtosecond lazer açın.
Lazerin deklanşöründen emin olun. Sonra mikroskop yazılımını açın. Uyarma lazerini 488 nanometre ye ayarlayın ve güç seviyesini 0,1 miliwatt olarak ayarlayın.
Görüntüleme boyutunu 512'ye 512 piksel, her pikselin aralık süresini 2,4 mikrosaniye olarak ayarlayın. Ardından, fotoğraf beyazlatma ve hücrelere fotoğraf hasarı en aza indirmek için altı saniye iki kare arasındaki aralık lı süreyi ayarlayın. Ayrıca, bireysel bir deneyde yaklaşık 30 dakika sürekli mikroskopi sağlamak için toplam görüntüleme çerçevelerini yaklaşık 300 kare olarak ayarlayın.
Kuvözden ERK2-GFP ile geçirilen Hela hücrelerini içeren yemeği alın ve kasedi sahneye koyun. Yazılımda, hızlı tarama moduna başlayın ve hücrelerin açık floresan görüntülerini elde etmek için hedefi ayarlayın. Ardından, ccd kamerayı kullanarak hızlı taramayı durdurun ve parlak alan görüntüleme moduna geçin.
Deklanşörü açın ve femtosecond lazer odakçapı yaklaşık iki mikron olduğundan emin olmak için röle teleskobun iki lens arasındaki mesafeyi ayarlayın. Ardından, ayarlamayı tamamlamak için deklanşörü kapatın. Femtosecond lazerin gücünü 810 nanometre lazer için 15 ila 40 miliwatt veya 1040 nanometre lazer için 20 ila 60 miliwatt olarak ayarlayın.
Ardından deklanşör açılış saatini 05 ila 0,2 saniye olarak ayarlayın. ERK2-GFP'yi güçlü bir şekilde ifade eden bir hedef hücre seçmek için hızlı tarama modunu kullanın. Bulunduktan sonra, seçili hedef hücrenin sitosol alanını yerelleştirmek için sahneyi parlak alan görüntüleme altında görüş alanının merkezinde olacak şekilde hareket ettirin.
Ortalandıktan sonra, sürekli görüntülemeye başlamak için başlat düğmesine tıklayın. Hedef hücreye femtosecond lazer stimülasyon sunmak için herhangi bir önceden tanımlanmış zaman diliminde deklanşör açın. Görüntüleme işlemi tamamlandığında, görüntüleme verilerini daha fazla analiz için kaydedin.
Femtosecond lazerin gücünü 15 ila 40 miliwatt ve 810 nanometre ve 20 ila 60 miliwatt ve 1040 nanometre olarak ayarlayın. Daha sonra, inkübatörden ERK2-GFP ile geçirilen hücreleri içeren çanak alın ve mikroskop aşamasına koyun. ERK2-GFP'yi iyi ifade eden hedef hücreyi seçmek için hızlı tarama modunu kullanın.
Daha sonra, konfokal görüntüleme işlemini ayarlayın ve görüntüleme işleminde uyarım çerçevesi olarak özel bir tarama çerçevesi tanımlayın. Stimülasyon çerçevesinin parametresini tanımlayın. Hedef hücredeki çekirdeğe yakın sitosol bölgesinde ikişer üçe üç mikrondan oluşan bir tarama bölgesi ayarlayın.
Toplam tarama süresini 0,1 ile 0,2 saniye olarak ayarlayın. İki kare arasındaki zaman aralığını altı saniyede ayarlayın ve toplam görüntüleme çerçevelerini yaklaşık 300 kare olarak ayarlayın ve yaklaşık 30 dakika sürekli mikroskopi sağlayın. Görüntüleme verilerini daha fazla veri analizi için kaydedin.
Femtosecond lazerin deklanşörünün, önceden tanımlanmış fotoğraf stimülasyon alanına göre konfokal tarama ile senkronize edin. Sürekli mikroskopi görüntüleme işlemini başlatmak için başlat düğmesini tıklatın. Mitokondriyal morfolojik dinamikleri gözlemlemek için, Mito-GFP ile transfect Hela hücreleri floresan mitokondriyi gösterir, ya da mito-cpYFP ile bir baz mitoflashes gözlemlemek için.
Transfeksiyondan sonra femtosecond lazeri açın ve deklanşörün kapalı olduğundan emin olun. Sonra, lazer tarama confocal mikroskobu açın. Uyarma lazerini 488 nanometreye ayarlayın.
Daha sonra, 488 nanometre lazergüç seviyesini 0.1 miliwatt ayarlayın. Ayrıca, görüntüleme boyutunu 512 piksele, her karenin toplam görüntüleme süresini 2,2 saniyeye ayarlayın. Daha sonra, iki kare arasındaki aralık süresini sıfır saniyede ve toplam görüntüleme çerçevelerini 200 kare olarak ayarlayın ve tek bir denemede yaklaşık 440 saniyelik sürekli mikroskopi sağlayın.
Mito GFP veya mitokondriyal hedefli dairesel permuted sarı floresan protein ile transfected hücreleri içeren çanak alın ve mikroskop aşamasında çanak koymak. Femtosecond lazer odak görüş alanının merkezinde bulunan olduğundan emin olmak için femtosecond lazer durumunu kontrol edin. Ardından, odak noktasının konumunu belirtmek için floresan görüntüleme penceresinin ortasına bir başvuru oku ayarlayın.
Daha sonra, 810 nanometre ve 1040 nanometre lazer için 10 ila 40 miliwatt lazer ile 5 ila 30 miliwatt olarak femtosecond lazer gücünü ayarlayın. Deklanşörün açılış saatini 05 ila 0,1 saniye olarak ayarlayın. Mito GFP'yi veya mitokondriyal hedefli dairesel permuted sarı floresan proteinini iyi ifade eden hedef hücreyi seçmek için hızlı tarama modunu kullanın.
Deneysel nesne olarak hedef hücrede rastgele bir mitokondri seçin. Daha sonra, referans oktarafından belirtildiği gibi hızlı tarama modu ile görüş alanının merkezindeki hedef mitokondriyal tübüler yapıyı yerelleştirmek için mikroskop aşamasını hareket ettirin. Sürekli görüntülemeye başlamak için başlat düğmesini tıklatın.
Son olarak, hedef mitokondriyal tübüler yapı içine femtosecond lazer stimülasyon sunmak için herhangi bir önceden tanımlanmış zamanda deklanşör açın. Görüntüleme işlemi tamamlanana kadar bekleyin ve daha fazla veri analizi için görüntüleme verilerini kaydedin. Bu protokolde sunulan yöntem kullanılarak ERK2 femtosecond lazerkısa bir flaş ile tedavi edildikten sonra çekirdeğe dönüşür.
ERK2-GFP floresanfemtosaniye lazer stimülasyon birkaç dakika sonra maksimum ulaşır. ERK2 molekülleri çekirdekteki aşağı yüzeyleri etkinleştirdikten sonra fosforilasyona tabi tutulacak ve erk2 nükleer GFP floresanının azalması ile gösterilen sitoplazmaya geri döner. ERK2 birden fazla fotoğraf stimülasyonu ile birden çok kez aktive edilebilir.
Bu nedenle, birden fazla uyaran arasındaki zaman aralığını kontrol ederek ERK2 sinyal desenini hassas bir şekilde işlemek mümkündür. Buna ek olarak, ERK2 bazen uyarılmış hücre etrafında bitişik hücrelerde aktive edilebilir. Bu gözlem, bazı diffusible moleküllerin bitişik hücrelerde ERK2 etkinleştirmek için femtosecond lazer ile tedavi hücre tarafından serbest bırakılabilir gösterir.
ERK2 downstream protein eIF4E fosforilasyon immünororesans mikroskopisi ile bireyselleştirilmiş doğrulanabilir. Bu sonuç, femtosecond lazer stimülasyonun ERK sinyal yolunu başarıyla aktive edebildiği anlamına geliyor. Mitokondriyal oksidatif yanıp söner veya mitoflashes karmaşık moleküler dinamikleri kök mitokondri oksidatif patlamalar vardır.
Bu fotoğraf stimülasyon şemasının uygulanması başarılı bir mitoflash uyarma ile sonuçlandı. Bu fotoğraf stimülasyonu aynı zamanda mitokondriyal morfolojinin parçalanması ve restorasyonu ile mitokondriyal membran potansiyelinin salınımını da içeren mitokondriyal moleküler dinamiğin çeşitlerini göstermektedir. Fotoğraf aktif mitoflashes benzer, bu mitokondri olaylar farklı güç yoğunlukları ile farklı performans var.
En önemli şey odak, boyut ve femtosecond lazer hassasiyeti hücrelerde stimülasyon için bir özellik olduğundan emin olmaktır. Yakın kızılötesi femtosecond lazer kullanıcılar için tehlikeli olabilir. Bu protokolü takip ederken, uygun koruma yıpratın ve lazerin optik tablodan dışarı yayınılmasını önler.
