Bu ex vivo co-kültür sistemi insan glioma hücre göçünün yeni hücresel ve moleküler mekanizmalarını tanımlamak için kullanılabilir ve potansiyel olarak in vitro ilaç etkinliği testi için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı gerçek zamanlı olarak insan glioblastoma hücreleri ve aksonarasındaki etkileşimleri çalışma yeteneğidir. Prosedürü gösteren John Zepecki, benim laboratuarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olacak.
Bölmeli kültür yemeklerini monte etmek için, steril distile suda mililitre başına 500 mikrogram kollajen stok çözeltisini seyreltin ve iyice karıştırın. Steril bir transfer pipetile, seyreltilmiş kollajen çözeltisi iki mililitre ile 35 milimetrelik kültür çanak doldurun. Sonra biraz çanak tilt ve arkasında kollajen ince bir film bırakarak çözeltiyi çıkarın.
Sonraki 35 milimetrelik çanak içine çözelti dağıtın. Tüm yemekler kaplanana kadar gerektiğinde daha fazla kollajen çözeltisi ekleyerek bu işlemi tekrarlayın. Kollajen polimerize etmek için, bir laminar akış kaputunda, konsantre amonyum hidroksit üç mililitre ile ıslak gazlı bez pedleri ve 15 dakika boyunca tepsileri kapsayacak.
Gazlı bez pedleri çıkarın ve 35 milimetrelik yemeklerin kurumasını bekleyin. Daha sonra, künt bir ipucu yapmak için 18 gauge iğne noktası kapalı dosya için metal bir dosya kullanın. Sterilize etmek için iğneyi %70 etanolle ıslatın.
Bölmeli haznenin dibine silikon gres uygulayın. Gresin düzgün cerendildiğinden ve her köşeye çakışdığından emin olun. Bu teknik çok zor layıcı olabilir, bu nedenle mükemmel bir büyüme sağlamak için bölmeli odaları kurmadan önce doğru miktarda gres uygulamaalıştırmanızı öneririz.
Yavaş çalışmak da çok önemlidir. Bir şeyler yanlış giderse ekstralar var, böylece ihtiyacınız olacağını düşünüyorum daha fazla oda ayarlayın. Kapağı 35 milimetrelik bir tabaktan çıkarın, kabı ters çevirin ve çizikleri odanın üzerine yerleştirin.
Bir çift forceps ile yavaşça yemeğin altına dokunun. Çanak yağ odaları uygularken, çok sert dokunmayın. Aksi takdirde aksonlar alttan bitişik odaya giremeyecektir.
Yavaşça çanak çevirmek için hemostatik forceps kullanın. Forcep'leri serbest bırak. Orta bölmenin tabanına bir yağ yığını yerleştirin.
Takviye nöronal bazal orta ile her oda doldurun. Gerektiğinde silikon gres ile sızıntıları ve mühür sızıntıları kontrol edin. Tüm kültür yemeklerini bir araya getirin ve bir gecede 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit tesakedin.
Bölmeli oda farklı farmakolojik reaktiflerin kullanımının yanı sıra aynı plaka üzerindeki iki kuyu arasındaki sonuçları karşılaştırma ve karşılaştırma olanağı sağlar. GBM nörosfer içeren hazırlanan kültürleri tohumlamak için, ilk her distal bölmeli odasında% 10 FBS içeren tamamlayıcı NBF ile orta değiştirin. Sonra, 10 mikrolitre ye ayarlanmış bir P20 pipet ile kültür çanaktan bir GBM nörosfer çizin.
Pipetin ucunu akson'a dokunmadan orta odaya en yakın distal hazneye yerleştirin ve GBM nörosferini yavaşça dışarı atarak aksonların üzerine yavaşça düştüğünü belirtin. GBM nörosferin intremiiçin izin vermek için oda sıcaklığında bir saat için biyogüvenlik kabine kültür bırakın. Bu yöntem beyin tümörlerinin tedavisi için farmakolojik bileşiklertest etmek için kullanılabilir.
Bu yöntem demiyelinating nöropatiler ve multipl skleroz gibi periferik ve merkezi sinir sisteminin diğer hastalıklara da uygulanabilir. Bu protokolde saflaştırılmış DRG aksonlar, kırmızı tümör belirteçleri GFAP ile gösterilen aksonal ağ içinde entegre edilmiş çift pozitif GFAP ve KI67 tümör benzeri yapılar oluşturan HCG'ler ile tohumlanmış, yeşil floresan proteini ifade eden hgc'ler ise aksonlar arasında göç etmiştir. Miyeline DRG oligodendrosit co-kültürlerde HGCs eklenmesi hgcs kırmızı lekeli miyelinated akson ile birlikte göç ve uzak psödopodi oluşumu yoluyla tümör kütlesinden gösterdi.
Bu teknik mükemmelleştirildikten sonra, insan GBM kök hücrelerinin gerçek zamanlı göçlerini incelemek için onu kullanabildik. Ayrıca yeni terapötik küçük molekül inhibitörleri eklenmesinden sonra hücre göçü üzerindeki etkileri çalışma başardık. Miyelinated oligodendrocyte DRG akson kültürünü istila eden GBM küresi burada gösterilmiştir.
Burada açıklanan protokol, yeni ilaç tedavilerinin etkilerini değerlendirmek üzere tasarlanmış diğer biyomimetik üç boyutlu ex vivo sistemleri için bir temel görevi görebılabilir. İnsan kaynaklı hücreleri işlerken her zaman dikkatli olunmalıdır. Uygun PPE giyilmeli ve kanyoluyla bulaşan patojen eğitimi tamamlanmalıdır, böylece hasta kaynaklı dokularla çalışmanın riskleri anlamalıdır.
Amonyum hidroksit özenle ele alınmalıdır ve eldiven, bir laboratuvar önlüğü giymek ve bu kimyasal maruz kalmaönlemek için bir başlık içinde çalışmak gerekir.
