מערכת זו לשעבר vivo שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לזהות מנגנונים תאיים ומולקולריים חדשניים של הגירת תאי גליומה אנושית, פוטנציאל לשמש בדיקות יעילות סמים במבחנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת ללמוד אינטראקציות בין תאי גליובלסטומה אנושיים לאקסונים בזמן אמת. מדגים את ההליך יהיה ג'ון Zepecki, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.
להרכבת מנות תרבות ממודרות, מדללים את תווי מלאי הקולגן ל-500 מיקרוגרם למיליליטר במים מזוקקים סטריליים ומערבבים היטב. עם פיפטה העברה סטרילית, למלא צלחת תרבות 35 מילימטר עם שני מיליליטר של פתרון קולגן מדולל. ואז מעט להטות את המנה ולהסיר את הפתרון משאיר סרט דק של קולגן מאחור.
לוותר על הפתרון לתוך המנה הבאה 35 מילימטר. חזור על תהליך זה, הוספת פתרון קולגן נוסף לפי הצורך עד שכל הכלים היו מצופים. כדי להפוך את הקולגן, במכסה המנוע לזרימה למינארית, רפידות גזה רטובות עם שלושה מיליליטר של אמוניום הידרוקסיד מרוכז ומכסים את המגשים במשך 15 דקות.
הסר רפידות גזה ולאפשר את הכלים 35 מילימטר להתייבש. לאחר מכן, להשתמש בקובץ מתכת כדי לתוגם את הנקודה של מחט מד 18 כדי להפוך את קצה קהה. משרים את המחט ב-70% אתנול כדי לעקר.
החל גריז סיליקון על החלק התחתון של התא ממודר. ודא שהשומן ממוקם בצורה מסודרת וחופף בכל הפינות. טכניקה זו יכולה להיות מאתגרת מאוד ולכן אנו ממליצים לך לקחת זמן נוסף כדי לתרגל החלת הכמות הנכונה של שומן לפני הגדרת התאים ממודרים על מנת להבטיח צמיחה מצוינת.
חשוב מאוד גם לעבוד לאט. הגדר יותר חדרים ממה שאתה חושב שאתה צריך אז יש לך תוספות צריך משהו להשתבש. מוציאים את המכסה מצלחת של 35 מ"מ, ממירים את המנה ומ מניחים את השריטות על התא.
הקש על החלק התחתון של המנה בעדינות עם זוג מדפים. בעת החלת תאי השומן על המנה, אין להקיש חזק מדי. אחרת, האקסונים לא יוכלו לצמוח מתחת לתא הסמוך.
השתמש במטלפים ההמוסטטיים כדי להפוך בעדינות את המנה. שחררו את המדפים. מניחים ערימת שומן בבסיס התא המרכזי.
מלאו כל תא במדיום בסיס עצבי נוסף. בדוק דליפות ודליפות חותם עם גריז סיליקון לפי הצורך. ממשיכים להרכיב את כל מנות התרבות ולאחסן לילה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
התא המודר מאפשר שימוש בריגנטים תרופתיים שונים, כמו גם את היכולת להשוות תוצאות ניגודיות בין שתי בארות על אותה צלחת. כדי לזרוע את התרבויות המוכנות המכילות נוירוספרה GBM, החלף תחילה את המדיום ב- NBF נוסף המכיל 10%FBS בכל תא דיסטלי. לאחר מכן, עם פיפטה P20 מוגדר 10 microliters, לצייר נוירוספרה GBM אחד מן צלחת התרבות.
מניחים את קצה הפיפסט בתא הדיסטלי הקרוב ביותר לתא המרכזי מבלי לגעת באקסון ולגרש את הנוירוספרה GBM לאט, כך שהיא נופלת בעדינות על האקסונים. השאירו את התרבות בארון ה-biosafety למשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לנוירוספרה GBM להיצמד. שיטה זו יכולה לשמש לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות לטיפול בגידולים במוח.
שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על מחלות אחרות של מערכת העצבים ההיקפית והמרכזית כגון נוירופתיות demyelinating ותטרשת נפוצה. בפרוטוקול זה, אקסונים DRG מטוהרים נזרעו עם HCGs אשר יצרו GFAP חיובי כפול ומבנים דמויי גידול KI67 משולבים בתוך רשת האקסונאלית המצוין על ידי סמני הגידול האדומים GFAP בעוד HGCs בודדים המבטאים את החלבון הפלואורסצנטי הירוק היגרו או בשיתוף או בין האקסונים. תוספת של HGCs על תרבויות DRG oligodendrocyte המייט הראה כי HGCs נודדים בשיתוף עם אקסונים מירלין מוכתמים אדום הרחק מסת הגידול באמצעות היווצרות של פסאודופודיה.
לאחר טכניקה זו היה מושלם, הצלחנו לנצל את זה כדי ללמוד הגירה של תאי גזע GBM אנושי בזמן אמת. הצלחנו גם ללמוד השפעות על נדידת תאים לאחר תוספת של מעכבי מולקולה קטנה טיפולית חדשנית. כדור GBM פולש לתרבות האקסון של אוליגודנדרוציטים מיונז DRG מוצג כאן.
הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש בסיס למערכות ביומימטיות אחרות של אקס ויוו תלת מימדיות שנועדו להעריך את ההשפעות של טיפולים תרופתיים חדשניים. יש תמיד לנקוט זהירות בעת טיפול בתאים שמקורם בבני אדם. PPE המתאים צריך להיות משוחק אימון פתוגן המועבר בדם יש להשלים כך אחד מבין את הסיכונים של עבודה עם רקמות המטופל נגזר.
אמוניום הידרוקסיד צריך להיות מטופל בזהירות ואתה צריך ללבוש כפפות, חלוק מעבדה, ולעבוד ברדס כדי למנוע חשיפה לכימיקל זה.
