Dieses ex vivo Co-Kultursystem kann verwendet werden, um neuartige zelluläre und molekulare Mechanismen der Migration menschlicher Gliomzellen zu identifizieren und könnte potenziell für In-vitro-Arzneimittel-Wirksamkeitstests verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, Wechselwirkungen zwischen menschlichen Glioblastomzellen und Axonen in Echtzeit zu untersuchen. Demonstrieren sie das Verfahren wird John Zepecki, ein Student aus meinem Labor.
Um fachkundige Kulturgerichte zusammenzubauen, verdünnen Sie die Kollagen-Lagerlösung auf 500 Mikrogramm pro Milliliter in sterilem destilliertem Wasser und mischen Sie sie gründlich. Mit einer sterilen Transferpipette eine 35 Millimeter große Kulturschale mit zwei Millilitern der verdünnten Kollagenlösung füllen. Dann leicht kippen Sie die Schale und entfernen Sie die Lösung einen dünnen Film von Kollagen zurück.
Geben Sie die Lösung in die nächste 35-Millimeter-Schale. Wiederholen Sie diesen Vorgang, indem Sie bei Bedarf weitere Kollagenlösung hinzufügen, bis alle Gerichte beschichtet sind. Um das Kollagen in einer laminaren Strömungshaube zu polymerisieren, nasse Gazepads mit drei Millilitern konzentriertem Ammoniumhydroxid und bedecken sie die Schalen für 15 Minuten.
Entfernen Sie Gaze-Pads und lassen Sie die 35-Millimeter-Geschirr trocknen. Als Nächstes verwenden Sie eine Metalldatei, um den Punkt einer 18-Spur-Nadel zu speichern, um eine stumpfe Spitze zu machen. Die Nadel in 70% Ethanol einweichen, um sie zu sterilisieren.
Tragen Sie Silikonfett auf die Unterseite der Fachkammer auf. Stellen Sie sicher, dass das Fett sauber platziert ist und sich an allen Ecken überlappt. Diese Technik kann sehr anspruchsvoll sein, daher empfehlen wir Ihnen, sich zusätzliche Zeit zu nehmen, um die richtige Menge fett zu üben, bevor Sie die einteilen Kammern aufstellen, um ein hervorragendes Wachstum zu gewährleisten.
Es ist auch sehr wichtig, langsam zu arbeiten. Richten Sie mehr Kammern ein, als Sie denken, damit Sie Extras haben, sollte etwas schief gehen. Entfernen Sie den Deckel von einer 35-Millimeter-Schale, invertieren Sie die Schale und legen Sie die Kratzer über die Kammer.
Tippen Sie vorsichtig mit einem Paar Zangen auf die Unterseite der Schale. Wenn Sie die Fettkammern auf die Schale auftragen, tippen Sie nicht zu hart. Andernfalls können die Axone nicht in die angrenzende Kammer hineinwachsen.
Verwenden Sie die hämostatischen Zangen, um die Schale sanft umzudrehen. Lassen Sie die Zange los. Legen Sie einen Fetthaufen an die Basis des Mittelfachs.
Füllen Sie jede Kammer mit ergänzten neuronalen Basalmedium. Prüfen Sie bei Bedarf auf Leckagen und Dichtungslecks mit Silikonfett. Setzen Sie die Montage aller Kulturgerichte fort und lagern Sie über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Die fachliche Kammer ermöglicht die Verwendung verschiedener pharmakologischer Reagenzien sowie die Möglichkeit, Ergebnisse zwischen zwei Brunnen auf derselben Platte zu vergleichen und zu kontrastieren. Um die vorbereiteten Kulturen zu säen, die eine GBM-Neurosphäre enthalten, ersetzen Sie zuerst das Medium durch ergänzte NBF, die 10%FBS in jeder distalen Kammer enthalten. Als nächstes, mit einer P20 Pipette auf 10 Mikroliter eingestellt, ziehen Sie eine GBM Neurosphäre aus der Kulturschale.
Legen Sie die Spitze der Pipette in die distale Kammer, die der Mittelkammer am nächsten liegt, ohne das Axon zu berühren, und vertreiben Sie die GBM-Neurosphäre langsam, so dass sie sanft auf die Axone fällt. Lassen Sie die Kultur im Biosicherheitsschrank für eine Stunde bei Raumtemperatur, damit die GBM-Neurosphäre befestigt werden kann. Diese Methode könnte verwendet werden, um pharmakologische Verbindungen für die Behandlung von Hirntumoren zu testen.
Diese Methode könnte auch auf andere Erkrankungen des peripheren und zentralen Nervensystems wie demyelinierende Neuropathien und Multiple Sklerose angewendet werden. In diesem Protokoll wurden gereinigte DRG-Axone mit HCGs gesät, die doppelt positive GFAP- und KI67-tumorähnliche Strukturen bildeten, die in das axonale Netzwerk integriert waren, die durch die roten Tumormarker GFAP angezeigt wurden, während einzelne HGCs, die das grüne fluoreszierende Protein exezieren, entweder in Verbindung oder zwischen den Axonen migrierten. Die Zugabe von HGCs an den myelinierten DRG-Oligodendrozyten-Kokulturen zeigte, dass HGCs in Verbindung mit den rot gebeizten myelinierten Axonen wandern und durch die Bildung von Pseudopodien von der Tumormasse weg wandern.
Sobald diese Technik perfektioniert wurde, konnten wir sie nutzen, um die Migration menschlicher GBM-Stammzellen in Echtzeit zu untersuchen. Wir waren auch in der Lage, Effekte auf die Zellmigration nach Zugabe von neuartigen therapeutischen kleinen Molekülinhibitoren zu untersuchen. Die GBM-Kugel, die in eine myelinierte Oligodendrozyten-DRG-Axonkultur eindringt, wird hier gezeigt.
Das hier beschriebene Protokoll könnte als Grundlage für andere biomimetische dreidimensionale Ex-vivo-Systeme dienen, die die Auswirkungen neuartiger Arzneimittelbehandlungen bewerten sollen. Beim Umgang mit vom Menschen abgeleiteten Zellen sollte man immer Vorsicht walten lassen. Entsprechende PSA sollten getragen und blutübertragene Krankheitserreger-Schulungen abgeschlossen werden, damit man die Risiken der Arbeit mit patientenabgeleiteten Geweben versteht.
Ammoniumhydroxid sollte mit Vorsicht behandelt werden und Sie sollten Handschuhe, einen Labormantel tragen und in einer Kapuze arbeiten, um eine Exposition gegenüber dieser Chemikalie zu verhindern.
