Este sistema de co-cultivo ex vivo se puede utilizar para identificar nuevos mecanismos celulares y moleculares de la migración de células de glioma humano y podría ser utilizado potencialmente para pruebas de eficacia de fármacos in vitro. La principal ventaja de esta técnica es la capacidad de estudiar las interacciones entre las células humanas del glioblastoma y los axones en tiempo real. Demostrando el procedimiento estará John Zepecki, un estudiante graduado de mi laboratorio.
Para ensamblar platos de cultivo enpartados, diluir la solución de colágeno a 500 microgramos por mililitro en agua destilada estéril y mezclar bien. Con una pipeta de transferencia estéril, llene un plato de cultivo de 35 milímetros con dos mililitros de la solución de colágeno diluida. A continuación, incline ligeramente el plato y retire la solución dejando atrás una fina película de colágeno.
Dispensar la solución en el siguiente plato de 35 milímetros. Repita este proceso, añadiendo más solución de colágeno según sea necesario hasta que todos los platos hayan sido recubiertos. Para polimerizar el colágeno, en una campana de flujo laminar, las almohadillas húmedas de gasa con tres mililitros de hidróxido de amonio concentrado y cubrir las bandejas durante 15 minutos.
Retire las gasas y deje que los platos de 35 milímetros se sequen. A continuación, utilice un archivo de metal para archivar el punto de una aguja de calibre 18 para hacer una punta contundente. Remoje la aguja en 70%etanol para esterilizar.
Aplique grasa de silicona en la parte inferior de la cámara compartida. Asegúrese de que la grasa esté bien colocada y se superponga en todas las esquinas. Esta técnica puede ser muy difícil, por lo que le sugerimos que se tome más tiempo para practicar la aplicación de la cantidad correcta de grasa antes de configurar las cámaras compartidas con el fin de garantizar un excelente crecimiento.
También es muy importante trabajar lentamente. Configura más cámaras de las que crees que necesitarás para que tengas extras en caso de que algo salga mal. Retire la tapa de un plato de 35 milímetros, invierta el plato y coloque los arañazos sobre la cámara.
Toque hacia abajo en la parte inferior del plato suavemente con un par de fórceps. Al aplicar las cámaras de grasa en el plato, no toque demasiado fuerte. De lo contrario, los axones no podrán crecer debajo de la cámara adyacente.
Use los fórceps hemostáticos para voltear suavemente el plato. Suelta los fórceps. Coloque un montículo de grasa en la base del compartimiento central.
Llene cada cámara con un medio basal neuronal suplementado. Compruebe si hay fugas y selle las fugas con grasa de silicona según sea necesario. Continúe ensamblando todos los platos de cultivo y almacene durante la noche a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono.
La cámara compartida permite el uso de diferentes reactivos farmacológicos, así como la capacidad de comparar y contrastar los resultados entre dos pozos en la misma placa. Para sembrar los cultivos preparados que contienen una neuroesfera GBM, primero reemplace el medio con NBF suplementado que contiene 10%FBS en cada cámara compartida distal. A continuación, con una pipeta P20 establecida en 10 microlitros, extraiga una neuroesfera GBM del plato de cultivo.
Coloque la punta de la pipeta en la cámara distal más cercana a la cámara central sin tocar el axón y expulse lentamente la neurosfera GBM para que caiga suavemente sobre los axones. Deje el cultivo en el gabinete de bioseguridad durante una hora a temperatura ambiente para permitir que la neurosfera GBM se adjunte. Este método podría utilizarse para probar compuestos farmacológicos para el tratamiento de tumores cerebrales.
Este método también podría aplicarse a otras enfermedades del sistema nervioso periférico y central como las neuropatías desmielinizantes y la esclerosis múltiple. En este protocolo, se sembraron a los axones DRG purificados con HCG que formaron estructuras de doble positivo GFAP y KI67 similares a tumores integradas dentro de la red axonal indicada por los marcadores tumorales rojos GFAP, mientras que los HGC individuales expresaron la proteína fluorescente verde migrada ya sea en asociación o entre los axones. La adición de HGCs en las coculturas mielinadas de oligodendrocitos DRG mostró que los HGCs migran en asociación con los axones mielinados teñidos de rojo y lejos de la masa tumoral a través de la formación de pseudopodia.
Una vez perfeccionada esta técnica, pudimos utilizarla para estudiar la migración de células madre GBM humanas en tiempo real. También pudimos estudiar los efectos sobre la migración celular después de la adición de nuevos inhibidores terapéuticos de moléculas pequeñas. Aquí se muestra la esfera GBM que invade una cultura de axón DRG de oligodendrocitos mielinado.
El protocolo descrito aquí podría servir como base para otros sistemas biomiméticos tridimensionales ex vivo diseñados para evaluar los efectos de nuevos tratamientos farmacológicos. Siempre se debe tener cuidado al manipular células derivadas del ser humano. Se debe usar un EPP adecuado y completar la formación de patógenos transmitidos por la sangre para que se comprenda los riesgos de trabajar con tejidos derivados del paciente.
El hidróxido de amonio debe manipularse con cuidado y debe usar guantes, una capa de laboratorio y trabajar en una capucha para evitar la exposición a este producto químico.
