Ce système de co-culture ex vivo peut être utilisé pour identifier de nouveaux mécanismes cellulaires et moléculaires de la migration cellulaire du gliome humain et pourrait potentiellement être utilisé pour des tests d’efficacité in vitro des médicaments. Le principal avantage de cette technique est la capacité d’étudier les interactions entre les cellules du glioblastome humain et les axones en temps réel. John Zepecki, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Pour assembler des plats de culture compartimentés, diluer la solution de bouillon de collagène à 500 microgrammes par millilitre dans de l’eau distillée stérile et bien mélanger. Avec une pipette de transfert stérile, remplir un plat de culture de 35 millimètres avec deux millilitres de la solution de collagène dilué. Inclinez légèrement le plat et retirez la solution en laissant derrière elle un mince film de collagène.
Distribuez la solution dans le plat suivant de 35 millimètres. Répétez ce processus, en ajoutant plus de solution de collagène au besoin jusqu’à ce que tous les plats aient été enduits. Pour polymériser le collagène, dans un capot d’écoulement laminaire, les tampons de gaze humide avec trois millilitres d’hydroxyde concentré d’ammonium et couvrir les plateaux pendant 15 minutes.
Retirer les tampons de gaze et laisser sécher les plats de 35 millimètres. Ensuite, utilisez un fichier métallique pour déposer le point d’une aiguille de calibre 18 pour faire une pointe émoussée. Faire tremper l’aiguille dans 70% d’éthanol pour stériliser.
Appliquer la graisse de silicone sur le fond de la chambre compartimentée. Assurez-vous que la graisse est bien placée et se chevauche à tous les coins. Cette technique peut être très difficile, donc nous vous suggérons de prendre plus de temps pour pratiquer l’application de la bonne quantité de graisse avant de mettre en place les chambres compartimentées afin d’assurer une excellente croissance.
Il est également très important de travailler lentement. Configurer plus de chambres que vous pensez que vous aurez besoin de sorte que vous avez des extras si quelque chose ne va pas. Retirer le couvercle d’un plat de 35 millimètres, inverser le plat et placer les rayures sur la chambre.
Appuyez doucement sur le fond du plat avec une paire de forceps. Lorsque vous appliquez les chambres à graisse sur le plat, ne tapez pas trop fort. Sinon, les axones ne pourront pas pousser en dessous dans la chambre adjacente.
Utilisez les forceps hémostatiques pour retourner doucement le plat. Relâchez les forceps. Placez un monticule de graisse à la base du compartiment central.
Remplissez chaque chambre d’un milieu basal neuronal complété. Vérifiez s’il y a des fuites et des fuites de joints avec de la graisse de silicone au besoin. Continuer à assembler tous les plats de culture et stocker toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
La chambre compartimentée permet l’utilisation de différents reagents pharmacologiques ainsi que la possibilité de comparer et de contraster les résultats entre deux puits sur la même plaque. Pour ensemencer les cultures préparées contenant une neurosphère GBM, remplacez d’abord le milieu par un NBF complété contenant 10 % de FBS dans chaque chambre compartimentée distale. Ensuite, avec une pipette P20 réglée sur 10 microlitres, tirez une neurosphère GBM du plat de culture.
Placez la pointe de la pipette dans la chambre distale la plus proche de la chambre centrale sans toucher l’axon et expulsez lentement la néurosphère GBM afin qu’elle tombe doucement sur les axones. Laissez la culture dans l’armoire de biosécurité pendant une heure à température ambiante pour permettre à la neurosphère GBM de s’attacher. Cette méthode pourrait être utilisée pour tester les composés pharmacologiques pour le traitement des tumeurs cérébrales.
Cette méthode pourrait également être appliquée à d’autres maladies du système nerveux périphérique et central telles que la démyélinisation des neuropathies et la sclérose en plaques. Dans ce protocole, les axones purifiés de DRG ont été ensemencés avec des HCGs qui ont formé les structures GFAP et KI67 tumeur-comme doubles positives intégrées dans le réseau axonal indiqué par les marqueurs rouges de tumeur GFAP tandis que les HGCs individuels exprimant la protéine fluorescente verte ont migré en association ou entre les axones. L’addition des HGCs sur les co-cultures myélinated d’oligodendrocyte de DRG a prouvé que les HGCs migrent en association avec les axones myélinated tachés rouges et loin de la masse de tumeur par la formation de pseudopodia.
Une fois cette technique perfectionnée, nous avons pu l’utiliser pour étudier la migration des cellules souches humaines gbm en temps réel. Nous avons également pu étudier des effets sur la migration cellulaire après addition de nouveaux inhibiteurs thérapeutiques de petite molécule. La sphère GBM envahissant une culture myélinée d’axon d’oligodendrocyte est montrée ici.
Le protocole décrit ici pourrait servir de base à d’autres systèmes biomimétiques ex vivo tridimensionnels conçus pour évaluer les effets de nouveaux traitements médicamenteux. Il faut toujours faire preuve de prudence lorsqu’on manipule des cellules d’origine humaine. L’EPI approprié devrait être porté et la formation d’agent pathogène d’origine sanguine devrait être accomplie ainsi on comprend les risques de travailler avec les tissus patients-dérivés.
L’hydroxyde d’ammonium doit être manipulé avec soin et vous devriez porter des gants, un manteau de laboratoire, et travailler dans une hotte pour empêcher l’exposition à ce produit chimique.
