Este sistema de co-cultura ex vivo pode ser usado para identificar novos mecanismos celulares e moleculares da migração de células glioma humanas e poderia potencialmente ser usado para testes de eficácia de drogas in vitro. A principal vantagem dessa técnica é a capacidade de estudar interações entre células de glioblastoma humanos e axônios em tempo real. Demonstrando o procedimento será John Zepecki, um estudante de pós-graduação do meu laboratório.
Para montar pratos de cultura compartimentados, diluir a solução de estoque de colágeno a 500 microgramas por mililitro em água destilada estéril e misturar completamente. Com uma pipeta de transferência estéril, encha um prato de cultura de 35 milímetros com dois mililitros da solução de colágeno diluído. Em seguida, incline ligeiramente o prato e remova a solução deixando um filme fino de colágeno para trás.
Dispense a solução para o próximo prato de 35 milímetros. Repita este processo, adicionando mais solução de colágeno conforme necessário até que todos os pratos tenham sido revestidos. Para polimerizar o colágeno, em uma capa de fluxo laminar, almofadas de gaze molhadas com três mililitros de hidróxido concentrado de amônio e cobrir as bandejas por 15 minutos.
Retire as almofadas de gaze e deixe os pratos de 35 milímetros secarem. Em seguida, use um arquivo de metal para arquivar o ponto de uma agulha calibre 18 para fazer uma ponta sem cortes. Mergulhe a agulha em 70% de etanol para esterilizar.
Aplique graxa de silicone na parte inferior da câmara compartimentada. Certifique-se de que a graxa está bem colocada e sobrepõe-se em todos os cantos. Esta técnica pode ser muito desafiadora, por isso sugerimos que você tire um tempo extra para praticar a aplicação da quantidade correta de graxa antes de configurar as câmaras compartimentadas, a fim de garantir um excelente crescimento.
Também é muito importante trabalhar devagar. Configure mais câmaras do que você acha que vai precisar para que você tenha extras se algo der errado. Retire a tampa de um prato de 35 milímetros, inverta o prato e coloque os arranhões sobre a câmara.
Bata no fundo do prato suavemente com um par de fórceps. Ao aplicar as câmaras de graxa no prato, não bata muito forte. Caso contrário, os axônios não serão capazes de crescer por baixo da câmara adjacente.
Use as fórceps hemostáticas para virar suavemente o prato. Solte os fórceps. Coloque um monte de graxa na base do compartimento central.
Encha cada câmara com meio basal neuronal suplementado. Verifique se há vazamentos e vazamentos de vedação com graxa de silicone conforme necessário. Continue montando todos os pratos da cultura e armazene durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
A câmara compartimentada permite o uso de diferentes reagentes farmacológicos, bem como a capacidade de comparar e contraste resultados entre dois poços na mesma placa. Para semear as culturas preparadas contendo uma neurosfera GBM, primeiro substitua o meio por NBF suplementado contendo 10% de FBS em cada câmara distal compartimentada. Em seguida, com uma pipeta P20 definida para 10 microliters, desenhe uma neurosfera GBM do prato de cultura.
Coloque a ponta da pipeta na câmara distal mais próxima da câmara central sem tocar no axônio e expulse a neurofera GBM lentamente para que caia suavemente sobre os axônios. Deixe a cultura no armário de biossegurança por uma hora à temperatura ambiente para permitir que a neurosfera GBM se conecte. Este método poderia ser usado para testar compostos farmacológicos para o tratamento de tumores cerebrais.
Esse método também pode ser aplicado a outras doenças do sistema nervoso periférico e central, como neuropatias desmielinizantes e esclerose múltipla. Neste protocolo, os axônios DRG purificados foram semeados com HCGs que formaram estruturas duplamente positivas semelhantes a tumores GFAP e KI67 integrados dentro da rede axonal indicada pelos marcadores tumorais vermelhos GFAP enquanto HGCs individuais expressando a proteína fluorescente verde migraram em associação ou entre os axônios. A adição de HGCs nas co-culturas oligodendrocyte mieliada drg mostrou que os HGCs migram em associação com os axônios mieliados manchados vermelhos e longe da massa tumoral através da formação de pseudopodia.
Uma vez aperfeiçoada essa técnica, pudemos utilizá-la para estudar a migração de células-tronco GBM humanas em tempo real. Também pudemos estudar efeitos na migração celular após a adição de novos inibidores terapêuticos de pequenas moléculas. A esfera GBM invadindo uma cultura de axônio oligodendrocyte meliado DRG é mostrada aqui.
O protocolo descrito aqui poderia servir de base para outros sistemas biomiméticos tridimensionais ex vivo projetados para avaliar os efeitos de novos tratamentos medicamentosos. Deve-se sempre ter cuidado ao manusear células derivadas do homem. Epi apropriado deve ser usado e o treinamento de patógenos transmitidos pelo sangue deve ser concluído para que se entenda os riscos de trabalhar com tecidos derivados do paciente.
Hidróxido de amônio deve ser tratado com cuidado e você deve usar luvas, um jaleco e trabalhar em um capuz para evitar a exposição a este produto químico.
