このex vivo共培養システムは、ヒトグリオーマ細胞遊走の新しい細胞および分子機構を同定するために使用することができ、インビトロ薬有効性試験に使用される可能性がある。この技術の主な利点は、ヒト神経膠芽腫細胞と軸索の相互作用をリアルタイムで研究する能力である。この手順をデモンストレーションするのは、私の研究室の大学院生であるジョン・ゼペリです。
コンパートメントされた培養皿を組み立てるには、無菌蒸留水中の1ミリリットル当たり500マイクログラムにコラーゲンストック溶液を希釈し、十分に混ぜます。滅菌移管ピペットで、希釈したコラーゲン溶液の2ミリリットルで35ミリメートル培養皿を充填します。その後、皿を少し傾け、後ろにコラーゲンの薄いフィルムを残して溶液を取り除きます。
次の35ミリメートル皿に溶液を分配します。このプロセスを繰り返し、必要に応じてすべての料理がコーティングされるまでコラーゲン溶液を追加します。コラーゲンを重合するために、ラミナルフローフードで、水酸化アンモニウムアンモニウムを3ミリリットルで濡れたガーゼパッドで、トレイを15分間覆う。
ガーゼパッドを取り外し、35ミリメートルの皿を乾燥させます。次に、金属ファイルを使用して18ゲージ針のポイントを取り除き、鈍い先端を作ります。70%エタノールに針を浸して滅菌します。
コンパートメントされたチャンバーの底部にシリコーングリースを塗布します。グリスがきれいに配置され、すべてのコーナーで重なっていることを確認します。この技術は非常に困難な場合があるので、優れた成長を確実にするために、コンパートメントされたチャンバーを設定する前に、適切な量のグリースを適用する練習に余分な時間を要することをお勧めします。
ゆっくり働くことも非常に重要です。あなたが何かがうまくいかない場合にエキストラを持っているので、あなたが必要と思うよりも多くの部屋を設定します。35ミリメートル皿から蓋を取り出し、皿を反転させ、部屋の上に傷を置きます。
皿の底を軽くタップして鉗子を付きます。グリースチャンバーを皿に塗布する際は、強くたたすぎないでください。それ以外の場合、軸索は隣接するチャンバーの下に成長することはできません。
静血鉗子を使用して、皿をひっくり返します。鉗子を解放する。中央コンパートメントの基部にグリースのマウンドを置きます。
各チャンバーに補い付けられた神経基底核培地を充填します。必要に応じて、シリコーングリースで漏れやシール漏れを確認します。すべての文化料理を組み立て続け、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩保管してください。
コンパートメントされた部屋は異なった薬理学的試薬の使用および同じ版の2つの井戸間の結果を比較し、対比する機能を可能にする。GBM神経球を含む調製された培養物をシードするには、まず各遠位コンパートメントチャンバに10%FBSを含む補充されたNBFで培地を交換する。次に、P20ピペットを10マイクロリットルにセットして、培養皿から1GBM神経球を引き出す。
軸索に触れることなく、中心室に最も近い遠位チャンバーにピペットの先端を置き、GBM神経球をゆっくりと排出して、軸索にそっと落ちるようにします。GBM神経球が付着できるように、培養液を常温で1時間、バイオセーフティキャビネットに残します。この方法は、脳腫瘍の治療のための薬理学的化合物をテストするために使用することができます。
この方法は、脱髄性神経障害および多発性硬化症などの末梢および中枢神経系の他の疾患にも適用することができる。このプロトコルでは、精製されたDRG軸索に、赤い腫瘍マーカーGFAPによって示された軸索ネットワーク内に統合された二重陽性GFAPおよびKI67腫瘍様構造を形成するHCGを播種し、緑色蛍光タンパク質を発現する個々のHGCは関連または軸索間で移動した。髄膜化されたDRGオリゴデンドロシテの共培養物にHGCを添加すると、HGCは赤い染色されたミエリン軸索と関連して移動し、疑似ポディアの形成を通じて腫瘍塊から離れて移動することを示した。
この技術が完成すると、ヒトGBM幹細胞の移動をリアルタイムで研究することができました。また、新しい治療用低分子阻害剤を添加した後の細胞遊びへの影響を研究することができました。髄膜化されたオリゴデンドロシテDRG軸索培養物に侵入するGBM球をここに示す。
ここで説明するプロトコルは、新しい薬物治療の効果を評価するために設計された他のバイオミメティック3次元ex vivoシステムの基礎として役立つ可能性があります。人間由来の細胞を扱うときは、常に注意を払う必要があります。適切なPPEを着用し、血液媒介病原体のトレーニングを完了して、患者由来の組織で作業するリスクを理解する必要があります。
水酸化アンモニウムは注意して取り扱う必要があり、手袋、ラボコートを着用し、この化学物質への暴露を防ぐためにフードで作業する必要があります。
