Biz onların 3C protokol paylaşımı için çok Adelle Murell ve Kurt Reik teşekkürler. Bu çalışma ve Gazi İşleri Departmanı Araştırma Servisi Savunma Bakanlığı tarafından desteklenmiştir.

1. Uzun menzilli kromatin etkileşimleri formaldehit fiksasyonu <ol><li> % 5 CO 2 ile birlikte bir kuluçka% 15 FBS ve% 80-90 izdiham 1 x penisilin / streptomisin Kültür insan hücre hattı RPMI1640 orta HL-60, 37 ° C </li><li> Hücreler 1200 rpm&#39;de 15 dakika boyunca 50 ml Nunc tüp, santrifüj içine toplayın ve sonra aspirasyon orta kaldırmak </li><li> Hücre pelletleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak hücreleri saymak için 5 ml kültür ortamı ekleyin. RPMI1640 /% 10 FBS, 40 ml hacmi yaklaşık 1 x 10 7 hücreler, daha sonra seyreltilmiş kromatin düzeltmek için 1.7 ml% 37 formaldehit ekleyin. </li><li> Nazik sallayarak 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin ve sonra 2.4 ml 2M glisin ile soğutun. 1200 rpm&#39;de 15 dakika santrifüj 4 ° C ve süpernatant kaldırmak. Pelet 40 ml buz PBS ile bir kez yıkayın, sonra pelet aşağı spin ve PBS kaldırmak. </li></ol> 2. Çekirdekleri izole etmek için hücre parçalama <ol><li> 40 ml taze proteaz inhibitörleri (1:500 seyreltme) ve 0.1 mM PMSF buz lizis tamponu (10 mM Tris-HCl, pH8.0, 10 mM NaCl,% 0.2 NP-40) yeniden süspanse edin hücreleri. 90 dakika, 15 dakika 2500 rpm&#39;de santrifüj rotasyon ile soğuk bir odaya inkübe ve supernatant çıkarın. </li></ol> 3. BGL II Kısıtlama enzim sindirimi <ol><li> 1 x NEB tampon 3 0.5 ml çekirdekleri süspanse edin ve 15 μlof% 10 SDS ekleyin. Sallayarak ile 1 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin, sonra Triton X-100 SDS ayırmak için% 20 45 ul ekleyin. Ile 37 ° C &#39;de 1 saat süreyle sallayarak inkübe edin. </li><li> Restriksiyon enzimi sindirim için 1 x 10 6 çekirdek (yaklaşık 15 mg, özgün hücrelere onda biri) bir kısım kullanın. Adım 3.1 &#39;den 55 ul çekirdekleri çözüm çıkarın ve 1 x NEB tampon BGL II (50U/ul) 3 ve 12 ul ul 433 ile 500 ul makyaj. 37 ° ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li></ol> 4. Etkileşim DNA segmentleri ligasyonu <ol><li> Restriksiyon enzimi inaktive 65 ısıtarak 95% 10 SDS ul ve doğasını ekleyerek ° C su banyosunda 20 dakika. </li><li> 1 x ligasyonu tamponu (30 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl 2, 10 mM DTT, 1 mM ATP) ve% 20 Triton X-100 360 ul 7 ml ve 1 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe . </li><li> 16 daha düşük sıcaklığa ° C ve 400 U / ml T4 DNA ligaz 50 ul ekleyin. 4 saat 30 dakika sonra oda sıcaklığında numune 16 ° C&#39;de inkübe edin ve. </li></ol> 5. DNA Saflaştırma <ol><li> Proteinaz K 300 mg ekleyin ve 65 ° C&#39;de bir gece inkübe edin. </li><li> 37 A ve inkübe ° C 30 dakika boyunca 5 mg RNaz ekle </li><li> Izopropanol fenol / kloroform ekstraksiyon ve çökelti DNA DNA arındırın. DNA 150 ul steril distile su ile çözülür. </li></ol> 6. Msp I Sindirim ve oligonükleotid linkers ile ligasyon <ol><li> 4-6 saat için 37 ° C Msp I 5 adet saflaştırılmış DNA 2μg inkübe edin. 65 yaşında ben Msp inaktive ° C de 10 dakika sonra 5 mg / ml glikojen 1 ul etanol içinde DNA hızlandırabilir . DNA pelet 50 ul steril distile su ile çözülür. </li><li> 20 mcM linker oligonükleotid L 2 ul ile 50 ul Msp I ile tedavi edilen DNA Mix (5&#39;-gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac-3 &#39;), 1 ul 20 mcM oligonükleotid S (5&#39;-cggtgaatc 3&#39;), 1 ul steril distile su ve 10 x T4 DNA ligaz tamponu 6 ul. Karışımı sıvı balmumu ile kaplayın. </li><li> Doğasını oligonükleotidler 50 ° C ° C 1 dakika ve 10 ile yavaş yavaş soğumasını bekleyin termal cycler 0.5 ° C / dakika degrade. </li><li> 400 U / ml T4 DNA ligaz 1 ul ekleyin ve 15 ° C gecede inkübe. Linker bağlanan QIAquick PCR Arıtma kiti kullanılarak DNA ve steril distile su ile 50 ul Zehir arındırın. </li></ol> 7. PCR ve dizi analizi <ol><li> DNA uzun menzilli etkileşimler (yani, &#39;yem&#39;) incelemek için istediğiniz belirli bir bölge için bir astar seçin. Bu örnekte, biz ABL-1 kullanır. </li><li> Gerçekleştirmek için 20 mcM 1 ul kullanarak ilk turda PCR ABL -1 özel astar # 4656 (5&#39;-gttcaagcgattctcctgcctcga-3 &#39;), 20 mcM 1 ul linker özel astar # 2963 (1 ul saflaştırılmış DNA 5&#39;- gctgaccctgaattcgcacgtgcct-3 &#39;), 3 x Klen Taq DNA polimeraz I kokteyl ve steril distile su ile 3 ul 3μl. 32 P-dCTP İki ul ul PCR önce 3 x Klen Taq DNA polimeraz I kokteyl 100 eklenir. Son uzatma 95 18 döngüleri ° C, 20 saniye boyunca 65 ° C 40 saniye ve 72 ° C 1 dakika boyunca; sıcak bir başlangıç ​​PCR için termal döngüsü 72 ° C 2 dk, 95 ° Cfor 2 dakika 72 ° C5 dakika. </li><li> 30 ul steril distile su QIAquick PCR Arıtma kiti ve Zehir DNA kullanarak ilk tur PCR ürünleri arındırın. </li><li> 20 mcM 1 ul ABL-1 spesifik primer # 4626 (5&#39;-ggagaatttttatctgcctctgtga-3 &#39;) (Şekil 1a), 1 ul ekleyerek iç içe primerler kullanılarak PCR ikinci turda gerçekleştirmek için ilk PCR ürünü seyreltilmiş 100 x 1 ul atın 20 mcM linker özel astar # 2961 (5&#39;-gtcgttagcggacacagggcgattc-3 &#39;), steril distile su ul 3 x Klen Taq DNA polimeraz I kokteyli ve 3 3 ul. Termal bisiklet programı 25 devir 95 ° C, 20 saniye boyunca 67 ° C 40 saniye ve 72 ° C, 72 ° C&#39;de 5 dakika uzatma takip 1 dakika. </li><li> PCR ürünleri% 5 üre-PAGE jel çalışan ve bir PhosphoImager maruz ekran (Şekil 1b) tarama gözünüzde canlandırın. Her PCR bant Eppendorf tüp içinde 60 ul steril distile su içeren bir jel şeritler çözme ve 95 ° C&#39;de 5 dakika inkübe jel geri dönüştürülebilir. Tüm örnekleri toplamak için 10 saniye boyunca 10.000 rpm kısaca santrifüjleyin. Yukarıda açıklandığı gibi aynı koşullar kullanarak primer çifti 2961/4626 PCR işlemi gerçekleştirmek için DNA şablon olarak kullanmak için 1 ul çıkarın. Dizi analizleri QIAquick PCR Arıtma kiti kullanılarak arıtma sonra yapılabilir. </li><li> Http://genome.ucsc.edu (Şekil 1c): DNA dizilerinin web sitesinde kendi kromozomal konumunu belirlemek için bir online araç kullanılarak analiz edilmektedir. &#39;Blat&#39; bir DNA dizisi yapıştırmak için olanak sağlayan yeni bir pencere girmek için tıklayın, yeni bir pencere &#39;to&#39; tıkladıktan sonra görünür ve &#39;Blat Arama Sonuçları&#39; gösterir. DNA dizisi yerini göstermek için bir sonraki pencerede girmek için% 100 kimliği ile hit &#39;tarayıcı&#39; tıklayın. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar 1. ABL-1 bölge yem olarak kullanarak, uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için ACT testinin Şekil 1a, iki BGL II siteleri ve bir BamH I site gösterildiği gibi ACT tayini için seçilmiştir. PCR ikinci turda, astar 4626/2961 ABL-M1 yükseltmek için kullanılan set, 4630/2961 ABL-M2 için kullanılan ve 4636/2961 ABL-M3 için kullanılmıştır. Tipik bir jel desen çeşitli gruplarda (Şekil 1b) birini gösterir. Parçanın bir ACT testi her iki kombine DNA segmentleri oluşur: ikinci segment yem bölge segmentinde ilk restriksiyon enzim tanıma dizisi katıldı ilişkili ortağı gelen bir kesimi, yem DNA bölgesi türetilmiştir. Ikinci enzim tanıma dizisi ilişkili ortağı dizisi (Şekil 1c) sonunda görünecektir. Klonlanmış ABL-M1 parçası +133,592,306-133,592,399 gelen kromozom 9q32.4 bulunan ABL1 bölgenin DNA içerir ve ilgili ortak +71,869,882-71,870,107 gelen kromozom 3p13 yer almaktadır. Ilgili ortakların kimlikleri UCSC genom tarayıcı (GRCh7/hg19 Şubat ayında yayınlanan, 2009) kullanarak kendi dizilerini patlatma tarafından keşfedildi. PROK2 chr3p13 lokustaki ilişkili ortağı olarak tespit edilmiştir. Benzer şekilde, klon ABL-M3 ABL-1 lokusu yakınındaki kromozom-içi bir dernek olarak tespit edilmiştir ABL-M2 ilişkili ortağı, chr5q21.1 lokalize idi. 2. ACT testinin daha az yaygın olan uzun menzilli etkileşimlerinin belirlenmesi 3C dayalı Diğer deneyleri, Şekil 1 ve Igf2 / H19 lokus 12 daha göstermiştir daha pek çok etkileşim ortakları bildirdin . Biz ana hatlarıyla olduğunu metodoloji en yaygın uzun menzilli etkileşimleri seçecektir. Ancak, PCR döngüleri sayısını artırarak, ek, daha az sıklıkta dernekler belirlemek de (Şekil 2) mümkündür. 3. Normal dokulara göre, kanser hücrelerinin uzun menzilli etkileşimleri farklar. ACT testi, normal hücreler ve kanser hücreleri (Şekil 3) arasındaki nükleer mimari farklılıkları ve uzun menzilli etkileşimleri de tanımlamak için kullanılır. Bu farklılıklar hücre dönüşümü sırasında meydana gelen nükleer mimari değişiklikleri yansıtmak ve böylece bu testte sonuçta tanısal amaçlı olabilir. Normal ve kanserli dokuların hem de ortaya çıkan benzer jel desen ACT testi güvenilir ve tekrarlanabilir olduğunu belirtti. ACT testi, FISH ve ChIP deneyleri gibi uzun menzilli DNA ortakları, daha fazla analiz, uzak merkezi arasında belirlenen derneklerin varlığını doğrulamak için gerekli olan belirleyebilir. Genetik, fizyolojik ve biyokimyasal çalışmalar, daha sonra bu uzun menzilli DNA dernek biyolojik etkileri aydınlatmak için yapılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 ACT testinin HL-60 hücrelerinde DNA yem olarak ABL-1 bölge. a. DNA yapısıABL-1 bölgede ure. ACT tayininde kullanılan ilk restriksiyon enzimini BGL II. Ikinci turu için PCR primerleri da oklar ve ilgili astar numaraları tarafından etiketlenir. b. % 5 üre-PAGE ACT testinin Gel desen. Primer çifti 4626/2961 nested PCR ABL-M1 klon yükseltme için kullanılan, 4630/2961 klonlamak ABL-M2 için kullanılan ve 4636/2961 klon ABL-M3 için kullanılır. c. Klon ABL-M1 DNA dizisi. ABL-1 yem DNA DNA parçası kırmızı etiketli ve ilgili DNA ortağı camgöbeği etiketlenir. BGL II sitesinde (AGACTC), yeşil etiketli ve Msp sitesi (CCGG) mor etiketlenir . <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 PCR döngüleri ACT testinin sonuçlarını etkileyebilir. Fare fibroblast hücreleri yem DNA olarak Igf2/H19 lokustaki imprinting kontrol bölgesi (ICR) kullanarak, farklı bisiklet programları ACT tayininde birinci ve ikinci tur PCR uygulandı. PCR ilk turda 18-20 döngüleri görüntülenebilmekte için yeterli sinyal yükseltmek değildi. Net bantlarında ikinci PCR sonuçları yirmi beş döngüleri, ikinci tur için PCR döngü sayısını artırırken, daha fazla bantlara ek olarak bir karalama deseni neden olmuştur. <img src="/files/ftp_upload/2621/2621fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 ACT testinin normal kolon doku ve kolon kanseri dokusu arasında nükleer mimarisinde farklılıklar Algılama a. ICR bölge IGF2/H19 lokus ve Igf2 gen DNA yapısı. ACT tayini için DPN II siteleri etiketlenir. Ikinci turda PCR kullanılan Astarlar karşılık, bu rakam panel b her kulvarın farklı renklerde oklar ve numaralarına göre etiketlenir. b. % 5 üre-PAGE ACT testinin Gel desen. Normal kolon dokusundan MAD03-1423 ve kolon kanseri dokusu MAD04-149 Kooperatif İnsan Doku Ağı (CHTN) Batı Bölümü elde edildi. Her kolon dokusundan homojenize edildikten sonra, ACT testinin Burada açıklanan prosedürleri takip yapıldı. Lane 1 primer çifti paneli pembe etiketli 2961and # 4161 # (5&#39;-tctgcgccatcagggcagtgagac-3 &#39;) kullanarak PCR sonuçları temsil eder; şeritli 2 primer çifti # 2961 # 4163 (5&#39;-gccgcgcggccacttccgattcc-3 kullanılarak PCR sonuçları temsil eder &#39;) paneli turuncu etiketli; 3 şeritli primer çifti # 2961 # 5145 (5&#39;-gccatgcaggtaggatttgagctg-3 kullanılarak PCR sonuçları temsil eder&#39; paneli mavi etiketli); şeritli 4, # 2961 primer çifti kullanılarak PCR sonuçları temsil eder. # 5151 (5&#39;-gtctcaaataggggccagctagcttgg-3 &#39;) panel a. yeşil etiketli Benzersiz bantlar normal kolon dokusunda sadece görünen sarı oklarla etiketli olup, sadece kolon kanseri dokusu ortaya çıktı bu bantları kırmızı oklar etiketlenir. ICR, basma kontrolü bölge; DMR, farklı metil bölge.

<ol>
	<li>Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+chromosome+conformation.">Capturing chromosome conformation.</a> Science. 295, 1306-1311 (2002).</li><li>Apostolou, E., Thanos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus+Infection+Induces+NF-kappaB-dependent+interchromosomal+associations+mediating+monoallelic+IFN-beta+gene+expression.">Virus Infection Induces NF-kappaB-dependent interchromosomal associations mediating monoallelic IFN-beta gene expression.</a> Cell. 134, 85-96 (2008).</li><li>Duan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+model+of+the+yeast+genome.">A three-dimensional model of the yeast genome.</a> Nature. 465, 363-367 (2010).</li><li>Lomvardas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+interactions+and+olfactory+receptor+choice.">Interchromosomal interactions and olfactory receptor choice.</a> Cell. 126, 403-413 (2006).</li><li>Murrell, A., Heeson, S., Reik, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+differentially+methylated+regions+partitions+the+imprinted+genes+Igf2+and+H19+into+parent-specific+chromatin+loops.">Interaction between differentially methylated regions partitions the imprinted genes Igf2 and H19 into parent-specific chromatin loops.</a> Nat Genet. 36, 889-893 (2004).</li><li>Schoenfelder, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells.">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat Genet. 42, 53-61 (2010).</li><li>Spilianakis, C. G., Lalioti, M. D., Town, T., Lee, G. R., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchromosomal+associations+between+alternatively+expressed+loci.">Interchromosomal associations between alternatively expressed loci.</a> Nature. 435, 637-645 (2005).</li><li>Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proximity+among+distant+regulatory+elements+at+the+beta-globin+locus+requires+GATA-1+and+FOG-1.">Proximity among distant regulatory elements at the beta-globin locus requires GATA-1 and FOG-1.</a> Mol Cell. 17, 453-462 (2005).</li><li>Xu, N., Tsai, C. L., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+homologous+chromosome+pairing+marks+the+onset+of+X+inactivation.">Transient homologous chromosome pairing marks the onset of X inactivation.</a> Science. 311, 1149-1152 (2006).</li><li>Lieberman-Aiden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326, 289-293 (2009).</li><li>Berkum, N. L. v. a. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Ling, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+mediates+interchromosomal+colocalization+between+Igf2/H19+and+Wsb1/Nf1.">CTCF mediates interchromosomal colocalization between Igf2/H19 and Wsb1/Nf1.</a> Science. 312, 269-272 (2006).</li><li>Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three+'C's+of+chromosome+conformation+capture:+controls,+controls,+controls.">The three 'C's of chromosome conformation capture: controls, controls, controls.</a> Nat Methods. 3, 17-21 (2006).</li></ol>

Dekker ve arkadaşları, iki genomik lokusların 1 arasındaki etkileşimi frekansı tespit etmek için kromozom konformasyon yakalama (3C) yaklaşımı geliştirdi ve 3C, memeli hücrelerinde 2 bilinen iki DNA bölgeleri arasında, intra-kromozomal ve inter-kromozomal dernekler araştırmak için yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır -9. Hi-C yeni geliştirilen metodoloji genom DNA dernek çalışması için uygulanabilir olsa da, ACT testinin hala lokus spesifik DNA etkileşimi 10-11 çalışması için etkili bir tekniktir . Biz bu yaklaşımı, kültürlü, fare ve insan hücreleri (Şekil 1) bilinen bir DNA bölgesi ile ilgili bilinmeyen DNA bölgeleri belirlemek için değiştirdiniz. Biz, bize bilinen bir hedef DNA bölgesi 12 ile ilişkilendirmek roman bilinmeyen DNA ortakları belirlemek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem olarak ilişkili kromozom tuzak (ACT) testi bu yöntem adında . ACT testinin 13 roman yönlerini çalıştırmadan önce gerekli kontrolleri ile başarılı bir 3C tahlil yapılır. Mümkün olduğunca çok sayıda ilgili DNA bölgeleri olarak tofind amacıyla, birinci ve ikinci kısıtlama enzimlerin çeşitli kombinasyonları kullanmak için gerekli. Bu, ilk 3C ligasyonu adımı gerçekleştirmeniz CpG metilasyon duyarsız restriksiyon enzimleri kullanmak için özellikle önemlidir. Protein bağlama ve DNA metilasyon kısıtlama enzim sindirimi verimliliği etkileyen ve belli bir restriksiyon enzimi sindirimler için ilgili DNA bölgeleri ligasyonu yetmezliğine yol açabilir. Intra-ve inter-kromozomal ligasyonu oluşumu, protein-DNA çapraz bağlama ve ilgili DNA bölgeleri hem de uygun fiziksel haritalar bağlıdır. Bu nedenle, bazı ön deneyler ACT testinin uygulanabilir bir etkin formaldehit konsantrasyonu ve tedavi süresi kurmak için gerekli. Formaldehit (from1.5% 2%) son konsantrasyonlarda bir dizi sırasında çeşitli laboratuvarlarında tahlil 7,9 3C kısmı kullanılmıştır. Alternatif olarak, linkers olarak kullanılan oligonükleotidler ikinci restriksiyon enzimi ile kesilen yapışkan son maç için dizayn edilebilir. 18-20, ikinci turda PCR PCR ve 20-25 döngüleri ilk turda döngüleri açık bantları sağlayabilir bulundu rağmen, her bir deney (Şekil 2) için en iyi PCR koşulları kurmak için gerekli. Molekül içi 5&#39;-end ve 3&#39;-ucundaki tamamlayıcı bir DNA iplikçik PCR oluşabilir adaptörü dizisi arasındaki tavlama, DNA molekülü ile tavlama adaptörü özel astar engeller ve ilk birkaç döngüleri çok düşük amplifikasyon verimliliğini sonuçlandı. Döngüleri için hedef DNA amplifiye sonra, miktarı bu nonspesifik reaksiyonlar çok daha büyük olabilir ve astar hedef DNA molekülleri tavlama rekabet kolaylaştırabilir. Arka plan amplifikasyon ve neden ilk turda PCR ürünü, PCR ikinci turda arka plan azaltmak için PCR reaksiyonu fazla primerleri kaldırmak için önemli arka plan amplification.It azaltmak için seyreltilerek neden bu aynı zamanda. PCR tabanlı tüm deneylerde olduğu gibi, insan ve fare DNA çoğunluğu oluşturan Tekrar dizisi bölgelerinde bulunmayan primerler tasarımı için hayati önem taşımaktadır. Hi-C yeni geliştirilen metodoloji genom DNA dernek çalışması için uygulanabilir olsa da, ACT testinin hala lokus spesifik DNA etkileşimi çalışması için etkili bir tekniktir.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>RPMI1640 medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>22400-105</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15512-023</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ATP solution, 10mM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM8110G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>fetal bovine serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>penicillin-streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1M Tris pH8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>AM9856</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>12091-039</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SDS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15525-017</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>urea</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15505-035</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BamH I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0136T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bgl II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0144M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dpn II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0543T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Msp I</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>R0106S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dNTPs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>N0447L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>P8102S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>T4 DNA ligase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NEB Biolabs</td>
<td>M0202T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>37% formaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F8775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bis-acrylamide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>146072</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dithiothreitol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>43815</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>glycine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>50046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSF</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>93482</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>proteinase inhibitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>S8830</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nonidet P-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Applied Science</td>
<td>11754599001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KlenTaq1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ab peptides</td>
<td>1001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dCTP alpha P32</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>BLU513H250UC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PTC-100 Thermal Cycler</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MJ Research</td>
<td>mjptc100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Power Supply</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bio-Rad</td>
<td>164-5056</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OmniPAGE Maxi</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aurogene Life Science</td>
<td>VS20D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Typhoon 9400</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare </td>
<td>63-0055-78</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

associated chromosome trap for identifying long-range dna interactions

Genetik bilgi DNA tarafından kodlanan karmaşık ve oldukça düzenli bir kromatin yapısı içinde organize edilir. Her kromozom, geliştirme veya hücre döngüsü evresine göre değişebilir belirli bir bölge, kaplar. Gen ifadesi, özel transkripsiyonel fabrikalarda oluşabilir uzak aynı kromozom üzerinde farklı kromozomlar veya mevcut DNA segmentleri co-lokalizasyon kromatin segmentlerinde lider, çeşitli kromozom topraklarından döngü çıkışı. Associated Kromozom Trap (ACT), tahlil, tarafsız bir biçimde uzanan ve kromozom konformasyon yakalama tekniğini değiştirerek bu uzun menzilli DNA dernekler tanımlamak için etkili bir yöntem sağlar. ACT testi trans transkripsiyonel düzenleme mekanizmalarının araştırılması için mümkün kılar ve normal fizyoloji ve hastalık durumlarında sırasında nükleer mimarisi gen ekspresyonu arasındaki ilişkiyi açıklamaya yardımcı olabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions at JoVE.com

Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Ilişkili kromozom tuzak (ACT) tayini uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için bir romanı tarafsız bir yöntemdir. Uzun menzilli DNA etkileşimleri karakterizasyonu gen ekspresyonu normal fizyoloji hem de hastalıklı devletlerin nükleer mimari ilişkiyi belirlemek için izin verecektir.

Uzun menzilli DNA Etkileşimleri belirlenmesi için İlişkili Kromozom Tuzak

Genetic information encoded by DNA is organized in a complex and highly regulated chromatin structure.  Each chromosome occupies a specific territory, ...

associated-chromosome-trap-for-identifying-long-range-dna-interactions

Research

JoVE Journal

Biology

14.4K Görüntüleme.  Stanford University School of Medicine. Ilişkili kromozom tuzak (ACT) tayini uzun menzilli DNA etkileşimleri belirlemek için bir romanı tarafsız bir yöntemdir. Uzun menzilli DNA etkileşimleri karakterizasyonu gen ekspresyonu normal fizyoloji hem de hastalıklı devletlerin nükleer mimari ilişkiyi belirlemek için izin verecektir.

Video: Associated Chromosome Trap for Identifying Long-range DNA Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput identification of protein-protein interactions (PPI) for full-length transmembrane proteins. To this end, our lab developed the split-ubiquitin based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) system. This technology allows for the sensitive detection of transient and stable protein interactions using Saccharomyces cerevisiae as a host organism. MYTH takes advantage of the observation that ubiquitin can be separated into two stable moieties: the C-terminal half of yeast ubiquitin (Cub) and the N-terminal half of the ubiquitin moiety (Nub). In MYTH, this principle is adapted for use as a 'sensor' of protein-protein interactions. Briefly, the integral membrane bait protein is fused to Cub which is linked to an artificial transcription factor. Prey proteins, either in individual or library format, are fused to the Nub moiety. Protein interaction between the bait and prey leads to reconstitution of the ubiquitin moieties, forming a full-length 'pseudo-ubiquitin' molecule. This molecule is in turn recognized by cytosolic deubiquitinating enzymes, resulting in cleavage of the transcription factor, and subsequent induction of reporter gene expression. The system is highly adaptable, and is particularly well-suited to high-throughput screening. It has been successfully employed to investigate interactions using integral membrane proteins from both yeast and other organisms.

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

MYTH allows the sensitive detection of transient and stable interactions between proteins that are expressed in the model organism Saccharomyces cerevisiae. It has been successfully applied to study exogenous and yeast integral membrane proteins in order to identify their interacting partners in a high throughput manner.

Split-Ubiquitin Dayalı Membran Maya İki Hybrid (MİT) Sistemi: protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için güçlü bir araç

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

Biyoloji

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

Antikor Etiketleme Drosophila politen Kromozom kabak hazırlanması

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic three-dimensional spring made of light that is formed when a high-intensity laser beam is focused to a very small spot by a microscope's objective lens. To bend a cell, we first bind live bacteria to a chemically-treated coverslip. As these cells grow, the middle of the cells remains bound to the coverslip but the growing ends are free of this restraint. By inducing filamentous growth with the drug cephalexin, we are able to identify cells in which one end of the cell was stuck to the surface while the other end remained unattached and susceptible to bending forces. A bending force is then applied with an optical trap by binding a polylysine-coated bead to the tip of a growing cell. Both the force and the displacement of the bead are recorded and the bending stiffness of the cell is the slope of this relationship.

We present a protocol for bending filamentous bacterial cells attached to a cover-slip surface with an optical trap to measure the cellular bending stiffness.

Optik Tuzak kullanarak Bakteriyel Hücre Bükme Rijitlik Ölçüm

We developed a protocol to measure the bending rigidity of filamentous rod-shaped bacteria. Forces are applied with an optical trap, a microscopic ...

Chromosome Preparation From Cultured Cells

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as fluorescence in situ hybridization (FISH), this assay has the powerful ability to analyze individual cells for aberrations that involve gains or losses of portions of the genome&#160;and rearrangements involving one or more chromosomes. In humans, chromosome abnormalities occur in approximately 1 per 160 live births1,2, 60-80% of all miscarriages3,4, 10% of stillbirths2,5, 13% of individuals with congenital heart disease6, 3-6% of infertility cases2, and in many patients with developmental delay&#160;and birth defects7. Cytogenetic analysis of malignancy is routinely used by researchers and clinicians, as observations of clonal chromosomal abnormalities have been shown to have both diagnostic and prognostic significance8,9.&#160; Chromosome isolation is invaluable for gene therapy and stem cell research of organisms including nonhuman primates and rodents10-13.
Chromosomes can be isolated from cells of live tissues, including blood lymphocytes, skin fibroblasts, amniocytes, placenta, bone marrow, and tumor specimens. Chromosomes are analyzed at the metaphase stage of mitosis, when they are most condensed and therefore more clearly visible. The first step of the chromosome isolation technique involves the disruption of the spindle fibers by incubation with Colcemid, to prevent the cells from proceeding to the subsequent anaphase stage. The cells are then treated with a hypotonic solution and preserved in their swollen state with Carnoy&#39;s fixative. The cells are then dropped on to slides and can then be utilized for a variety of procedures. G-banding involves trypsin treatment followed by staining with Giemsa to create characteristic light and dark bands. The same procedure to isolate chromosomes can be used for the preparation of cells for procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY)14,15.

Chromosomes can be isolated from live cells such as lymphocytes or skin fibroblasts, and from organisms including humans or mice. These chromosome preparations can be further utilized for routine G-banding and molecular cytogenetic procedures such as fluorescence in situ hybridization (FISH), comparative genomic hybridization (CGH), and spectral karyotyping (SKY).

Kültür Hücrelerinin itibaren Kromozom Hazırlık

Chromosome (cytogenetic) analysis is widely used for the detection of chromosome instability. When followed by G-banding and molecular techniques such as ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

Kombine DNA-RNA Floresan<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and silencing of genes mediate the response of plants to environmental signals and developmental cues. Therefore, insights into the mechanisms that control plant gene expression are essential to gain a deep understanding of how biological processes are regulated in plants. The chromatin immunoprecipitation (ChIP) technique described here is a procedure to identify the DNA-binding sites of proteins in genes or genomic regions of the model species Arabidopsis thaliana. The interactions with DNA of proteins of interest such as transcription factors, chromatin proteins or posttranslationally modified versions of histones can be efficiently analyzed with the ChIP protocol. This method is based on the fixation of protein-DNA interactions in vivo, random fragmentation of chromatin, immunoprecipitation of protein-DNA complexes with specific antibodies, and quantification of the DNA associated with the protein of interest by PCR techniques. The use of this methodology in Arabidopsis has contributed significantly to unveil transcriptional regulatory mechanisms that control a variety of plant biological processes. This approach allowed the identification of the binding sites of the Arabidopsis chromatin protein EBS to regulatory regions of the master gene of flowering FT. The impact of this protein in the accumulation of particular histone marks in the genomic region of FT was also revealed through ChIP analysis.

Chromatin Immunoprecipitation Assay for the Identification of Arabidopsis Protein-DNA Interactions In Vivo

Chromatin immunoprecipitation is a powerful technique for the identification of DNA binding sites of Arabidopsis proteins in vivo. This procedure includes chromatin cross-linking and fragmentation, immunoprecipitation with selective antibodies against the protein of interest, and qPCR analysis of bound DNA. We describe a simple ChIP assay optimized for Arabidopsis plants.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Intricate gene regulatory networks orchestrate biological processes and developmental transitions in plants. Selective transcriptional activation and ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.