Küçük RNA sıralaması ve açık kaynak biyoinformatik araçları kullanarak normalleştirilmiş okumaları analiz etmek için tanımlanmış, tekrarlanabilir ve uzun süreli bir protokol geliştirdik. Stratejimizin en önemli avantajları, jel saflaştırma yoluyla mikroRNA'ları doğru bir şekilde toplaması ve mikroRNA'ların nasıl toplanılsa da biyoinformatik analizinin uygulanabildiğidir. MikroRNA'ların yüksek iş elde sıralaması hastalık mekanizmaları, mikroRNA'ların işlenmesi ve küçük RNA'lar sağlayan gen terapisi yaklaşımlarının doğru niceliği hakkında bilgi verebilir.
RNase'siz bir ortamda çalıştığınızdan ve tüm RNA ürünlerini prosedür boyunca buzda tuttuğundan emin olun. Jel kesme adımlarını görselleştirmek, görüntüleyenlerin akış aşağı uygulamaları için gereken ürünlerin doğru boyutunu belirlemelerine yardımcı olur. Üç ana adaptör ligasyonu için, 11 mikrolitre RNA'yı 1,5 mikrolitre ATP içermeyen 10X T4RNA ligaz reaksiyon tamponu, bir mikrolitre polietilen glikol ve 0,5 mikrolitre üç prime bağlayıcı ile birleştirin.
Numuneleri termocycler üzerinde 95 derecede 30 ila 40 saniye ısıtın ve ardından bir dakika buzüzerinde soğutulun. Bir mikrolitre T4RNA ligaz iki ekleyin ve reaksiyonu oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. Örnekler kuluçkaya yatarken, plastik bir döküme 0,8 milimetre ayrılmış cam plakalar arasında %15 poliacyrilamid jel dökün ve bir tarak takın.
Jel katılaştırıldığında, artık üre kuyularını yıkamak için tanka ve pipete 0,5 5X TBE ekleyin. Poliakrilamid jeli 375 voltta 25 dakika önceden çalıştırdıktan sonra, her numune arasında en az bir şerit bırakarak numuneleri yükleyin. Jel yönünü takip etmek ve jeli sabit 375 voltta çalıştırmak için asimetrik bir desende en az iki işaretçi kümesinden 20 mikrolitre yükleyin.
15 dakika sonra, koşmak geri kalanı için sabit bir 425 volt artış ve yaklaşık iki saat boyunca jel çalıştırın. Çalışma sonunda, cam plakalar jel kaldırmak ve plastik bir sayfa koruyucu üzerine jel yerleştirmek için bir plaka ayırıcı kullanın. Distile suyun 500 mikrolitre içinde ethidium bromür beş mikrolitre seyreltin ve üst ışık mavi marker hemen üzerinde marker şeritler üzerine boya ekleyin.
Daha sonra, ultraviyole ışık altında her şeritte alt marker üst jelleri kesmek ve laboratuvar sızdırmazlık filmi dört dört santimetre kare parçaları aktarmak için temiz bir jilet kullanın. 12 küçük kareler üretmek için yatay yaklaşık üç kesim ve dikey iki kesim ile jel kesin. Sızdırmazlık filminin üzerine 400 mikrolitre 0,3 molar sodyum klorür ekleyin ve jel parçalarını 1,5 mililitresilikonlu tüplere yönlendirin.
Numuneleri bir gecede dört derece lik bir fındıkçıda çalkalayın. Ertesi sabah, her bir süpernatantın 400 mikrolitresini yeni tüplere aktarın. Tüp başına mililitre glikojen ko-precipitant başına 15 miligram% 100 etanol ve bir mikrolitre ekleyin.
Sonra tüpleri eksi 80 derecede bir saat saklayın. Beş prime bağlayıcı ligasyon için, ilk çözülmüş örnekleri aşağı spin ve suda pelet resuspend. Daha sonra, her numuneye 100 mikromol beş prime bağlayıcı, bir mikrolitre T4RNA ligaz tamponu, bir mikrolitre 10 milimolar ATP ve bir mikrolitre polietilen glikol ekleyin.
Reaksiyonları buza koymadan önce 30 saniye boyunca 90 derecede ısıtın. Daha sonra her tüpe bir mikrolitre T4RNA ligaz ekleyin ve reaksiyonları oda sıcaklığında iki saat kuluçkaya yatırın. Ters transkripsiyon için, önsantrik tarafından örnekleri toplamak ve nükleaz içermeyen su 8,25 mikrolitre hava kurutulmuş pelet resuspend.
Tamamlayıcı DNA sentez kitinden 0,5 mikrolitre 100 mikromolar ters transkriptaz astar ve 5 mikrolitre 2X ters transkriptaz reaksiyon karışımı ekleyin. 42 santigrat derecede üç dakika sonra, bir termocycler 42 santigrat derece bir 30 dakikalık kuluçka için her örnek için 10X ters transkriptaz enzim 1.5 mikrolitre ekleyin. Nötralizasyondan sonra, 29,5 mikrolitre su, beş mikrolitre 10X taq tamponu, bir mikrolitre nükleozit trifosfat, iki mikrolitre 25 mikromolar ileri astar, 25 mikromolar ters astar iki mikrolitre, taq polimeraz 0,5 mikrolitre ve ters transkripsiyonu tamamlayıcı DNA 10 mikrolitre ile bir PCR reaksiyonu hazırlayın.
Sonra iki PCR reaksiyonu çalıştırın. Agarose jel arınma için, düşük erime agarose ile% 4 agarose jel hazırlamak ve yükleme boya ve 100 baz çifti ve 25 baz çifti boyutu belirteçleri ile jel üzerine PCR ürün 40 mikrolitre veya daha fazla yük. Jel çalıştırdıktan sonra, 125 baz çifti bandı üzerinde bant kesilmiş ve üreticinin talimatlarına göre bir jel çıkarma kiti kullanın.
Son sıra kitaplığını ölçmek için uygun ekipmanı kullanmadan önce jel bandını oda sıcaklığında tamponda eritmek için çalkalayın. Ardından, dizi verilerini analiz etmek için uygun açık kaynak biyoinformatik araçlarını kullanın. Bu temsili PCR reaksiyonu düşük erime agarose jel, elde edilen linker bağlayıcı ürün ve doymamış karşı doymuş örnekleri ile karşılaştırıldığında doğru klonlanmış ürünün edinimi görülebilir.
İnsan mikroRNA saç tokaları hizalama sonra, her çoğaltma mikroRNA okuma sayıları arasında güçlü bir uyum görülebilir. Toplam 306 mikroRNA türü tespit edildi ve mikroRNA 122'ye en fazla okuma sayısı saptandı. MikroRNA'ların doğru bir şekilde geri kazanılmasını sağlamak için jelleri uygun boyutta kesmeyi unutmamak önemlidir.
MikroRNA'ları sıraladıktan sonra, kullanıcılar ilgi dokularındaki mikroRNA dağılımını karakterize etmek için biyoinformatik analizi uygulayabilirler. Bu teknik, mikroRNA'ların nasıl işlendiğini ve bazı kanserlerde hangi mikroRNA kümelerinin değiştirildiğini belirlemek için kullanılmıştır. Ethidium bromür kullanırken ve ultraviyole ışık altında jellere bakarken dikkatli olun.
