Bu yöntem akciğer içinde inflamatuar genleri düzenleyen tahmin mikroRNA'ların ekspresyonunu değerlendirmek için nasıl akciğer-bağışıklık alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu teknik akciğer mikroRNA ekspresyonu dolaşan hormonların katkılarını belirlemek için basit bir yol sunuyor. Estrous döngüsü aşamasını değerlendirmek için, sekiz ila dokuz haftalık bir dişi fareyi elle dizginleyin ve vajinaya ultra saf su yla dolu 10 mikrolitrelik plastik pipetin ucunu tanıtın.
Bir numuneyi toplamak için 4-5 kez hafifçe yıkayın ve vajinal sıvının son floşkısmını cam bir kaydıranın üzerine yatırın. Sonra 20X büyütme bir ışık mikroskop altında lekesiz vajinal floş gözlemleyin. Ozon ve filtrelenmiş hava maruziyeti için, tel örgü kapaklı 1,2 litrelik cam kaplardan birine en fazla dört fare yerleştirin.
Bir cam kabı ozon odasına, bir tanesini de filtrelenmiş hava maruziyet odasına koyun. Daha sonra ozon konsantrasyonu milyonda iki parçaya ayarlayın ve üç saat sonra kabı nı çıkartın. Maruz kaldıktan dört saat sonra, ilk deneysel farenin maruz kalan deri yüzeyini %70 etanol ile dezenfekte edin ve kalp ve akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin.
Sıvı nitrojen bir 1.5 mililitreR-free RNase-free mikro santrifüj tüp batırmak için forceps kullanın ve sıvı azot hasat akciğer hızlı dondurma. Sonra tüm akciğer mascerate için paslanmaz çelik doku pulverizer kullanın ve iki 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler arasında pulverize doku bölünmüş. Aynı şekilde tüm hayvanların akciğerleri hasat ve pulverizing sonra, her örnek için guanidinium tiyosiyanat 500 mikrolitre ekleyin ve sırayla 18, 21 ve 23 gauge iğneler ile her doku homojenize.
Son homojenizasyondan sonra, 15 saniye boyunca girdap lamadan önce her numuneye 500 mikrolitre etanol ekleyin. Karışımları santrifüj için tek tek toplama tüplerinde tek tek spin sütunlarına yükleyin ve akışları atın. DNase 1 tedavisi için, başka bir santrifüj için her kolona 400 mikrolitre RNA yıkama tamponu ekleyin ve RNase içermeyen tüplerde numune başına 5 mikrolitre DNase 1 ve 75 mikrolitre DNA sindirim tamponunu karıştırın.
Oda sıcaklığında 15 dakikalık bir kuluçka için doğrudan sütun matrisler karışımı ekleyin, iki 400 mikrolitre RNA ön yıkama çözeltisi santrifüj ile yıkar takip. RNA'yı eleştirmek için, son bir santrifüj için her sütun matrisine doğrudan 35 mikrolitre DNase RNase içermeyen su ekleyin ve her numunenin toplam RNA konsantrasyonunu ve saflığını bir spektrofotometrede ölçün. Sonra RNA'yı eksi 80 derecede saklayın.
Küçük RNase retrotransktasyon için, örnek başına ters transkripsiyon reaksiyon karışımı bir tüp prewash çözeltisi 10 mikrolitre toplam RNA 200 nanogram ekleyin. Karıştırdıktan sonra, örnekleri kısaca santrifüj edin ve kuluçkaya yatıncaya kadar buza yerleştirin. Daha sonra, tüpleri 60 dakika boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın, ardından 95 santigrat derecede beş dakikalık kuluçka.
İkinci kuluçka sonunda, 20 mikrolitre ters transkripsiyon reaksiyonu başına 200 mikrolitre RNase içermeyen su ile CDNA seyreltin ve önceden yüklenmiş bir fare inflamatuar yanıt ve otoimmünite mikroRNA PCR dizi her kuyuya her reaksiyon karışımı örnek 10 mikrolitre ekleyin. Proestrus evresi yuvarlak şekilli ve iyi biçimli çekirdekli epitel hücrelerinin varlığı ile tanımlanabilir. Fare estrus aşamasında yken, yaymada yoğun olarak paketlenmiş nükleatlı, mısırlaşmış ve skuamöz epitel hücreleri kümeleri gözlenir.
Metestrus sırasında cornified epitel hücreleri ve polimorfonükleer lökositler görülür. Diestrus olarak, lökositler genellikle daha yaygındır. Dört fare akciğerinden çıkarılan RNA, gösterildiği gibi, mikrolitre başına 1198 ile 2178 nanogram arasında değişen nükleik asit konsantrasyonları ve 2,01 ile 2,02 arasında ortalama A260 ile A280 oranı ve 2,139 ile 2,223 arasında ortalama A260 ile A230 oranı gösterir.
Bu tabloda ozon ve filtrelenmiş hava maruzfareler arasında mikroRNA ekspresyonunda iki kat değişiklikler gösterilmiştir. 14 mikroRNA için microRNA hedef filtresi ve çekirdek analizinden sonra, anlamlı ifade günlüğü oranı ve P değerleri elde etmek için bu veriler microRNA hedef filtresi ile eşlenebilir. Çekirdek analiz ayrıca kanonik yollar, hastalıklar ve fonksiyon, düzenleyiciler ve ağlar hakkında bilgi sağlar.
Ayrıca, fonksiyonel analiz yazılımı ilgi ve diğer moleküllerin mikroRNA'lar arasındaki ilişkiyi gösteren bir ağ analizi üretmek için kullanılabilir. Bu yordamı denerken, bir denemeyi gerçekleştirmeden önce estrus döngüsünü günlük olarak en az üç ardışık döngü için denetlemek önemlidir. Bu prosedürü takiben, estrus döngüsü boyunca akciğer inflamatuar gen ekspresyonu ile ilgili ek soruları cevaplamak için başka yöntemler de yapılabilir.
Bu teknik geliştikten sonra, akciğer bağışıklığı alanında diğer araştırmacılar ın diğer modelleri kullanarak seks hormonu düzenleme mekanizmalarını keşfetmelerinin önünü açmıştır.
