Abbiamo sviluppato un protocollo definito, riproducibile e di lunga data per il sequenziamento di piccoli RNA e per l'analisi delle letture normalizzate utilizzando strumenti di bioinformatica opensource. I principali vantaggi della nostra strategia sono che raccoglie accuratamente i microRNA attraverso la purificazione del gel e che l'analisi bioinformatica può essere applicata indipendentemente da come vengono raccolti i microRNA. Il sequenziamento ad alta produttività dei microRNA può rivelare informazioni sui meccanismi della malattia, sull'elaborazione dei microRNA e sull'accurata quantificazione degli approcci di terapia genica che forniscono piccoli RRNA.
Assicurati di lavorare in un ambiente privo di RNasi e di mantenere tutti i prodotti RNA sul ghiaccio durante tutta la procedura. La visualizzazione delle fasi di taglio del gel aiuterà gli spettatori a identificare le dimensioni corrette dei prodotti necessari per le applicazioni downstream. Per tre legature di adattatori primi, combinare 11 microlitri di RNA con 1,5 microlitri di tampone di reazione ligasi 10X T4RNA privo di ATP, un microlitro di glicole polietilene e 0,5 microlitri di tre linker primi.
Riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius su un termociclo per 30-40 secondi, seguito dal raffreddamento sul ghiaccio per un minuto. Aggiungere un microlitro di T4RNA ligasi due e incubare la reazione a temperatura ambiente per due ore. Durante l'incubazione dei campioni, versare un gel di poliacirilammide del 15% tra piastre di vetro separate da 0,8 millimetri in una colata di plastica e inserire un pettine.
Quando il gel si è solidificato, aggiungere 0,5 5 TBE 5X al serbatoio e pipettare vigorosamente per lavare vigorosamente i pozzi dell'urea residua. Dopo aver pre-esvolto il gel di poliacrilammide per 25 minuti a 375 volt, caricare i campioni lasciando almeno una corsia tra ciascun campione. Caricare 20 microlitri di almeno due serie di marcatori in un modello asimmetrico per tenere traccia dell'orientamento del gel ed eseguire il gel a 375 volt costanti.
Dopo 15 minuti, aumentare a una costante 425 volt per il resto della corsa ed eseguire il gel per circa due ore. Alla fine della corsa, utilizzare un separatore di piastra per rimuovere il gel dalle lastre di vetro e posizionare il gel su una protezione della pagina di plastica. Diluire cinque microlitri di bromuro di etidio in 500 microlitri di acqua distillata e aggiungere il colorante sulle corsie marcatori appena sopra il marcatore azzurro superiore.
Successivamente, utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare i gel dal marcatore superiore a quello inferiore in ogni corsia sotto la luce ultravioletta e trasferire i pezzi in un quadrato di pellicola di tenuta di laboratorio di quattro per quattro centimetri. Tagliare il gel con circa tre tagli orizzontalmente e due tagli verticalmente per produrre 12 piccoli quadrati. Aggiungere 400 microlitri di cloruro di sodio molare 0,3 sul film di tenuta e guidare i pezzi di gel in tubi siliconizzati da 1,5 millilitri.
Agitare i campioni su un nutator a quattro gradi Celsius durante la notte. La mattina seguente, trasferire 400 microlitri di ogni supernatante in nuovi tubi. Aggiungere un millilitro di etanolo al 100% e un microlitro di 15 milligrammi per co-precipitante di glicogeno millilitro per tubo.
Quindi conservare i tubi a meno 80 gradi Celsius per un'ora. Per cinque legazioni prime del linker, ruotare prima i campioni scongelati e rimostrare il pellet in acqua. Successivamente, aggiungere 0,5 microlitri di 100 micromolare cinque prime linker, un microlitro di tampone di ligasi T4RNA, un microlitero di 10 millimolare ATP e un microlitro di polietilene glicole ad ogni campione.
Riscaldare le reazioni a 90 gradi Celsius per 30 secondi prima di metterle sul ghiaccio. Quindi aggiungere un microlitro di T4RNA ligasi uno a ciascun tubo e incubare le reazioni a temperatura ambiente per due ore. Per la trascrizione inversa, raccogliere i campioni per centrifugazione e rimescolare il pellet essiccato all'aria in 8,25 microlitri di acqua priva di nucleasi.
Aggiungere 0,5 microlitri di primer di trascrittasi inversa micromolare 100 micromolare e cinque microlitri di mix di reazione trascrittasi inversa 2X da un kit di sintesi del DNA complementare. Dopo tre minuti a 42 gradi Celsius, aggiungere 1,5 microlitri di enzima transcriptasi inversa 10X a ciascun campione per un'incubazione di 30 minuti a 42 gradi Celsius in un termociclo. Dopo la neutralizzazione, preparare una reazione PCR con 29,5 microlitri di acqua, cinque microlitri di tampone taq 10X, un microlitro di trifosfato nucleoside, due microlitri di primer in avanti micromolare, due microlitri di primer inverso micromolare, 0,5 microlitri di taq polimerasi e 10 microlitri del DNA complementare trascritto inverso.
Quindi eseguire due reazioni PCR. Per la purificazione del gel di agarosio, preparare un gel di agarosio al 4% con agarosio a bassa fusione e caricare 40 microlitri o più del prodotto PCR sul gel con colorante di carico e 100 coppie di basi e 25 marcatori di dimensioni della coppia di basi. Dopo aver estrato il gel, tagliare la fascia sopra la fascia della coppia di basi 125 e utilizzare un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
Agitare per sciogliere la banda di gel in tampone a temperatura ambiente prima di utilizzare l'apparecchiatura appropriata per quantificare la libreria di sequenze finali. Quindi utilizzare gli strumenti di bioinformatica opensource appropriati per analizzare i dati della sequenza. In questa reazione rappresentativa pcr su gel di agarosio a bassa fusione, si può osservare l'acquisizione del prodotto clonato corretto rispetto al prodotto linker del linker ottenuto e campioni insaturi rispetto a quelli saturi.
Dopo l'allineamento ai tornanti di microRNA umani, si può osservare una forte concordanza tra i conteggi delle lette di microRNA in ogni replica. Un totale di 306 specie di microRNA sono state rilevate con il maggior numero di letture mappate al microRNA 122. È importante ricordare di tagliare i gel alla dimensione appropriata per consentire un recupero accurato dei microRNA.
Dopo aver sequenziato i microRNA, gli utenti possono applicare un'analisi bioinformatica per caratterizzare la distribuzione di microRNA all'interno dei loro tessuti di interesse. Questa tecnica è stata utilizzata per identificare come vengono elaborati i microRNA e quali insiemi di microRNA vengono alterati in alcuni tumori. Assicurati di prestare attenzione quando maneggia il bromuro di etidio e quando guardi i gel sotto la luce ultravioletta.
