我々は、小さなRNAシーケンシングとオープンソースバイオインフォマティクスツールを用いた正規化された読み取り解析を分析するための、定義された、再現性のある、そして長年のプロトコルを開発しました。当社の戦略の主な利点は、ゲル精製を通じてマイクロRNAを正確に収集し、マイクロRNAの収集方法に関係なくバイオインフォマティクス分析を適用できることです。マイクロRNAの高スループットシーケンシングは、疾患メカニズム、マイクロRNAの処理、および小さなRNAを提供する遺伝子治療アプローチの正確な定量化に関する洞察を明らかにすることができます。
RNaseフリーの環境で動作し、手順を通してすべてのRNA製品を氷の上に保つようにしてください。ゲル切削ステップを視覚化することで、下流アプリケーションに必要な製品の正しいサイズを見極めるのに役立ちます。3つの素数アダプターライゲーションの場合、11マイクロリットルのRNAを1.5マイクロリットルのATPフリー10X T4RNAリガーゼ反応バッファー、ポリエチレングリコール1マイクロリットル、3つのプライムリンカーの0.5マイクロリットルと組み合わせます。
サーモサイクラーで95°Cでサンプルを30~40秒間加熱し、氷の上で1分間冷却します。T4RNAリガーゼ2の1マイクロリットルを加え、2時間室温で反応をインキュベートします。サンプルがインキュベートされている間に、プラスチック鋳造で0.8ミリメートル分離ガラス板の間に15%ポリアシリルアミドゲルを注ぎ、櫛を挿入します。
ゲルが固まったら、タンクに0.5 5X TBEを加え、ピペットを激しく加えて残留尿素のウェルを洗浄します。ポリアクリルアミドゲルを375ボルトで25分間前走した後、各サンプルの間に少なくとも1車線を残してサンプルをロードする。20マイクロリットルのマーカーを非対称パターンにロードして、ゲルの向きを追跡し、一定の375ボルトでゲルを実行します。
15分後、残りの走行のために一定の425ボルトに増加し、約2時間ゲルを実行します。実行の最後に、プレートセパレータを使用してガラス板からゲルを取り除き、ゲルをプラスチックページプロテクターに置きます。5マイクロリットルのエチジウム臭化物を500マイクロリットルの蒸留水で希釈し、トップライトブルーマーカーのすぐ上のマーカーレーンに染料を加えます。
次に、きれいなカミソリの刃を使用して、紫外線下の各レーンの上部から下のマーカーにゲルをカットし、実験室のシーリングフィルムの4センチメートル四方に作品を移します。ゲルを水平に約3カット、垂直に2カットで切り、12個の小さな正方形を作り出します。400マイクロリットルの0.3モル塩化ナトリウムを封止フィルムに加え、ゲル片を1.5ミリリットルのシリコンチューブに導きます。
一晩摂氏4度でヌテーターのサンプルを攪拌します。翌朝、各上清の400マイクロリットルを新しいチューブに移します。100%エタノールの1ミリリットルと1ミリリットルの15ミリグラムの1ミリリットルを1本のグリコーゲン共沈殿物をチューブあたりに加えます。
その後、マイナス80度で1時間チューブを保存します。5つのプライムリンカーライゲーションの場合、まず解凍したサンプルをスピンダウンし、ペレットを水中に再懸濁させます。次に、0.5マイクロモル5プライムリンカー、T4RNAリガーゼバッファー1マイクロリットル、1マイクロリットルの10ミリモルATP、および各サンプルにポリエチレングリコール1マイクロリットルを加えます。
反応を氷の上に置く前に、摂氏90度で30秒間加熱します。次に、各チューブにT4RNAリガーゼ1マイクロリットルを加え、室温で2時間反応をインキュベートします。逆転写の場合は、遠心分離によってサンプルを収集し、空気乾燥ペレットを8.25マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水で再懸濁します。
100マイクロモル逆転写酵素プライマーの0.5マイクロモル逆転写酵素と相補的なDNA合成キットから2X逆転写酵素反応ミックスの5マイクロリットルを追加します。摂氏42度で3分後、サーモサイクラーで摂氏42度で30分間インキュベーションするために、各サンプルに10倍の逆転写酵素1.5マイクロリットルを加えます。中和後、29.5マイクロリットルの水、5マイクロリットルの10X taqバッファー、1マイクロリットルのヌクレオシド三リン酸、25マイクロモルフォワードプライマーの2マイクロリットル、25マイクロモル逆プライマーの2マイクロリットル、taqポリメラーゼの0.5マイクロリットル、および10マイクロリットルの逆転分解DNAを用いてPCR反応を調製する。
次に、2 つの PCR 反応を実行します。アガロースゲル精製の場合、低融解アガロースを含む4%アガロースゲルを調製し、40マイクロリットル以上のPCR産物をローディング色素と100塩基対および25塩基対サイズマーカーでゲルにロードします。ゲルを実行した後、125塩基対バンドの上にバンドをカットし、メーカーの指示に従ってゲル抽出キットを使用します。
適切な装置を使用して最終的なシーケンスライブラリを定量化する前に、ゲルバンドを室温でバッファーに溶解させます。次に、適切なオープンソースバイオインフォマティクスツールを使用して、シーケンスデータを分析します。この代表的なPCR反応では、低メルトアガロースゲルに対して、得られたリンカー産物と不飽和対飽和サンプルと比較して正しいクローン生成物の獲得が観察できる。
ヒトマイクロRNAヘアピンにアライメントした後、各反復におけるマイクロRNA読み取りカウント間の強い一致が観察される。マイクロRNA 122にマッピングする読み取りの数が最も多い合計306種のマイクロRNAが検出された。マイクロRNAの正確な回復を可能にするために、ゲルを適切なサイズで切断することを忘れないでください。
マイクロRNAをシーケンシングした後、ユーザーは、関心のある組織内のマイクロRNAの分布を特徴付けるためにバイオインフォマティクス分析を適用することができます。この技術は、マイクロRNAがどのように処理され、特定の癌でどのマイクロRNAのセットが変化するかを特定するために使用されてきた。臭化エチジウムを取り扱う際や、紫外線下でゲルを見る際には、必ず注意してください。
