Aşağıdaki protokol, çoklu mea plakaları üzerinde insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyosit ağlarının geliştirilmesini açıklamaktadır. Eylem potansiyeli parametreleri daha sonra elektrofizyoloji için bileşikleri test etmek için bu tepki eğrileri oluşturmak için kullanılabilir. Multiwell MEA kodlama ve hücre kaplaması özel dikkat gerektiren en zorlu adımlardır.
Damlacıkların yayılmasını ve kurumasını önlemek için bu adımları özenle ve hızlı bir şekilde yerine getirilmelidir. Uygulama ile, bu kolayca aşılabilir. Biz tek segmentasyon, kalite güvencesi ve parametre çıkarma için özel bir grafik kullanıcı arayüzü geliştirdi.
Sağlam MATLAB iş akışımız, büyük hacimli ham deneysel verileri hızla etkileyerek, etki potansiyeli dalga formlarının tarafsız bir gruplandırmasına dönüştürmek için uygulanmıştır. El yazması yönlere göre insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositleri eriterek başlayın. Hücre kümelerini ayrıştırmak için transfer pipetini kullanarak hücreleri yavaşça askıya alın.
Daha sonra dikkatlice bir substrat kaplı altı kuyu plaka her kuyuiçine hücre süspansiyon iki mililitre dağıtmak ve 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir hücre kültürü kuluçka plaka yerleştirin. Hücreler jel yollarına 24 saat yapışmalı ve kaplamadan sonra 48 saat kendiliğinden çırpılmalıdır. Kaplamadan iki gün önce, 24 kuyulu çok elektrotlu dizinin veya MEA plakasının her kuyusuna 0,5 mililitre insan iPSC kardiyomiyosit kültür ortamı ekleyin ve MEA'ların kalite kontrolü olarak sinyal-gürültü oranını doğrulamak için temel bir kayıt yapın.
Daha sonra, medya aspire, steril su ile kuyuları durulayın ve bir gecede bir laminar akış kaputu bir UV ışığı altında sterilize. Ertesi gün, MEA yüzeylerin hidrofilik tedavi için her kuyuya 0,1 mililitre FBS ekleyin ve 30 dakika oda sıcaklığında plaka kuluçkaya yatırın. Sonra FBS aspire ve steril su 0,5 mililitre ile her iki kez iyi durulayın.
Bir gecede laminar akış kaputunda kurumaya plaka bırakın. Ertesi gün, pipet çalışan fibronektin seyreltme beş mikrolitre ve dikkatle tüm 12 elektrotlar kapsayacak şekilde her kuyunun merkezinde damlacık dağıtmak. Plakayı hemen tüm bulaşık yüzeyini kaplayacak kadar steril su içeren nemlendirici bir haznenin içine yerleştirin.
Üç saat boyunca hücre kültürü kuluçka plaka ile oda yerleştirin ve daha sonra hücre kaplama ile devam edin. Kardiyomiyositleri kaplamaya hazır olduğunuzda, insan iPSC kardiyomiyosit eritme ortamda seyrelterek mikrolitre başına hücre yoğunluğunu 6.000 hücrelere ayarlayın. Hücrelerin tortulanmasıiçin hafif hareket ler kullanın.
MEA plakasını laminar akış kaputuna getirin ve elektrotlara dokunmadan p10 pipetiyle fibronektin damlasını dikkatlice çıkarın. Hemen kuyunun ortasına beş mikrolitrelik bir hücre damlacığı dağıtın ve 12 elektrotun hepsini kapsamasını sağlar. Fibronektin in kuruma sını önlemek için bir seferde iyi bir şey yapın.
Kaplama bittiğinde, MEA plakasını gevşek kapalı nemlendirici haznesine geri yerleştirin ve üç saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin. Kuluçkadan sonra, hücreleri rahatsız etmeden her kuyuya 200 mikrolitre insan iPSC kardiyomiyosit eritme ortamı nı dikkatlice eklemek için bir P200 pipetkullanın. MEA plakasını hücre kültürü kuluçka makinesine geri yerleştirin ve kaplamadan 24 saat sonra kültür ortamını değiştirin.
Kardiyomiyositlerden sinyal almaya hazır olduğunuzda, satın alma yazılımını başlatın ve MEA plakasını el yazması talimatlara göre yerleştirin. Tüm kuyularda sinyali görselleştirmek ve sabit durumda sinyal kalitesini doğrulamak için Keşfet düğmesini tıklatın. Alan potansiyeline sahip elektrotlar veya milivolt aralığındaki FP sinyalleri hakkında notlar alın.
Sonra keşif durdurmak için aynı düğmeye tıklayın. Bu noktaya kadar hiçbir veri kaydedilmedi. Kayda başlamak için Git düğmesini tıklatın.
Her kuyudaki elektrotlar ham veri penceresinde FP sinyallerini gösterir. 30 saniye lik kayıttan sonra Uyarı düğmesine tıklayın ve elektroporasyonun seçili sitelerde 30 saniye boyunca gerçekleşmesine izin verin. Ardından simülasyonu durdurmak ve 60 saniye boyunca kaydetmeye devam etmek için aynı düğmeye tıklayın.
Çeşitli alan potansiyelini ve eylem potansiyeli veri parametrelerini segmente etmek ve ayıklamak için MATLAB tabanlı özel yazılımı kullanın. İlk olarak, dalga formu analiz kodunu çalıştırın ve Dosya'ya tıklayın ve Process.h5'i seçin. Daha önce oluşturulmuş mwd'yi bulun ve seçin.
h5 dosyası. Çıktı dosyalarının depolama konumunu değiştirmek için Dizin Kaydet düğmesini tıklatın. Ardından elektrot ve iyi ilgi kombinasyonlarını seçip Sıra düğmesini tıklatarak bir sinyal işleme kuyruğu oluşturun.
Kuyruğa daha fazla elektrot ve kuyu kombinasyonları eklemek için bu adımı tekrarlayın. Hücreler ilaçlarla tedavi edildiyse, sıra doğrudan Med Name, Med Concentration'a tıklayarak düzenlenebilir. Kuyruk kesinleştikten sonra, sinyallerin tanımlandığı ve segmentasyon için ayıklandığı ön işleme başlayacak olan Initialize Waveforms düğmesini tıklatın.
İşlem tamamlandığında, Yakınlaştır düğmesini tıklatın ve eylem potansiyelini veya AP'yi seçin. Tut düğmesini tıklatın ve panelleri gözden geçirin. Zirveler ve çukurlar her dalga formu için algılanır ve normalleştirilmiş AP'ler üst üste bindirilir.
Bittiğinde, kuyruktaki bir sonraki iz için Tut düğmesini tıklatın ve elektrot ve kuyu kombinasyon sinyallerinin geri kalanı için işlemi yineleyin. Çözülen kardiyomiyositlerin canlılığı ve kaplama yoğunluğu çok well MEA kültürü için çok önemlidir. Doğru kaplama, 48 saat spontan dayak ile sağlıklı bir monolayer kültür ile sonuçlanır, kötü hücre canlılığı olmayan miyosit popülasyonların yüksek yüzdesi ile kültürlerde sonuçlanır.
Hücre damlacık dağılımı kültür yoğunluğunu etkiler ve hatta hücre ölümüne yol açabilir, bu yüzden kesin hücre yerleşimi önemlidir. MEAs üzerinde kültürhücreleri kaplama sonra elektrik aktivitesi için bir kalite kontrolü tabi tutulur 48 saat. Bir ağdaki elektrotların %50'si ve toplam ağların %70'i FP sinyalleri üretmiyorsa, kültür yetersizdir.
Elektroporasyon aracılı AP kayıtları mea kaplama sonrası 48 saat sonra birden çok kez elde edilebilir. Aynı hücre bölgesinin sıfır, 24, 48, 72 ve 96 saat deki çoklu elektroporasyonlarının zaman içinde AP şekli üzerinde önemli bir etkisi yoktur. Ayrıca, aynı hücre bölgesinden FP ve post elektroporasyon AP genlikleri arasında bir korelasyon gözlenmiştir.
Bu yöntemin önemli bir avantajı, çok iyi MEA plakasının birden çok kez yeniden kullanılabilmesidir. Bu dizinin güvenilirliğini göstermek için, 3, 815 AP dalga formları üç restorasyon toplu luktan çıkarılır ve sonuçların tekrarlanabilirliğini incelemek için AP süresi verileri ayıklanır. İlgilendiğinde, spesifik iyonik akımların davranışını araştırmak için gen ekspresyonu, kalsiyum geçici ölçümleri ve yama kıskacı gibi ek tahliller yapmak mümkündür.
Bu teknik, araştırmacıların elektrofizyolojik olgunlaşmayı geliştirmelerinin yanı sıra kardiyomiyositler üzerindeki kronik doz etkilerini taramalarının da önünü açıyor.
