يصف البروتوكول التالي تطور شبكات cardiomyocyte المستمدة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية التي يسببها الإنسان على ألواح MEA متعددة المستويات لتكترول أغشية الخلايا بشكل عكسي لإجراء قياسات محتملة. ويمكن بعد ذلك استخدام المعلمات المحتملة للعمل لتوليد منحنيات الاستجابة هذه لاختبار المركبات للفيزياء الكهربائية. متعددة الwell MEA الترميز وطلاء الخلايا هي الخطوات الأكثر تحديا التي تحتاج إلى اهتمام خاص.
يجب على المرء أن يؤدي هذه الخطوات بجد وبسرعة لمنع قطرات تنتشر وتجفيف. مع الممارسة، وهذا يمكن التغلب عليها بسهولة. قمنا بتطوير واجهة مستخدم رسومية مخصصة لتجزئة واحدة، وضمان الجودة واستخراج المعلمة.
تم تنفيذ سير العمل المتين القوي لـ MATLAB للحد بسرعة من كميات كبيرة من البيانات التجريبية الخام إلى مجموعة غير متحيزة من أشكال الموجات المحتملة للعمل. تبدأ من خلال ذوبان الخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المشتقة من الخلايا الجذعية التي يسببها الإنسان وفقاً لتوجيهات المخطوطات. قم بتعليق الخلايا بلطف باستخدام ماصة نقل لتفكك كتل الخلية.
ثم الاستغناء بعناية مليلترين من تعليق الخلية في كل بئر من صفيحة ستة جيدا المغلفة الركيزة ووضع لوحة في حاضنة ثقافة الخلية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. يجب أن تلتزم الخلايا بمساحات الجل لمدة 24 ساعة وتضرب تلقائيًا في 48 ساعة بعد الطلاء. قبل يومين من الطلاء إضافة 0.5 ملليلتر من الإنسان iPSC القلبية المتوسطة لثقافة القلب إلى كل بئر من 24 جيدا متعدد الأقطاب صفيف، أو لوحة MEA، وإجراء تسجيل خط الأساس للتحقق من نسبة إشارة إلى الضوضاء كفحص جودة الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف.
ثم، التعرق وسائل الإعلام، وشطف الآبار مع الماء المعقم، وتعقيم تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في غطاء محرك تدفق لارينار بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، إضافة 0.1 ملليلتر من FBS إلى كل بئر للعلاج المائي من الأسطح MEA واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم تُفطّن الـ FBS، وتشطف كل بئر مرتين بـ 0.5 ملليلتر من الماء المعقم.
اتركي اللوحة لتجف في غطاء تدفق الفارم بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، الماصات خمسة ميكرولترات من تخفيف الليفية العمل والاستغناء بعناية القطيرات في وسط كل بئر لتغطية جميع الأقطاب 12. ضع على الفور الطبق على سطح مرفوع داخل غرفة ترطيب تحتوي على ما يكفي من المياه المعقمة لتغطية سطح الطبق بأكمله.
ضع الغرفة مع لوحة في الحاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث ساعات ثم المضي قدما مع طلاء الخلايا. عندما تكون على استعداد لطبقة cardiomyocytes، وضبط كثافة الخلية إلى 6،000 الخلايا في microliter عن طريق تمييع لهم في القلب iPSC الإنسان ذوبان وسط. استخدم الخفقان اللطيف للحفاظ على الخلايا من الترسب.
جلب لوحة MEA في غطاء محرك تدفق لاريتار وإزالة بعناية قطرة فيبرومينكين مع ماصة P10 دون لمس الأقطاب الكهربائية. الاستغناء فورا عن قطرات خلية خمس ميكرولتر إلى وسط البئر مع التأكد من تغطية جميع الأقطاب الكهربائية 12. القيام بذلك بشكل جيد واحد في وقت واحد لمنع الليفي من التجفيف.
عند الانتهاء من الطلاء، ضع لوحة MEA مرة أخرى في غرفة الترطيب المغطاة بشكل فضفاض وإعادته إلى حاضنة ثقافة الخلية لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة، واستخدام ماصة P200 لإضافة بعناية 200 ميكرولترات من القلب iPSC الإنسان ذوبان المتوسطة لكل بئر دون إزعاج الخلايا. ضع لوحة MEA مرة أخرى في حاضنة ثقافة الخلية واستبدل الثقافة المتوسطة بعد 24 ساعة من الطلاء.
عندما تكون جاهزة للحصول على إشارة من cardiomyocytes، بدء اقتناء البرمجيات وإدراج لوحة MEA وفقا لتوجيهات المخطوطات. انقر فوق الزر استكشاف لتصور الإشارة في جميع الآبار والتحقق من جودة الإشارة في ظروف ثابتة. تدوين الملاحظات على الأقطاب الكهربائية مع إمكانية الحقل، أو FP، إشارات في نطاق ميليفولت.
ثم انقر على نفس الزر لوقف الاستكشاف. ولم تسجل بيانات حتى هذه اللحظة. انقر فوق الزر الانتقال لبدء التسجيل.
الأقطاب الكهربائية في كل بئر سوف تظهر إشارات FP في نافذة البيانات الخام. بعد 30 ثانية من التسجيل، انقر على زر تنشيط والسماح للكهربة أن تجري على المواقع المختارة لمدة 30 ثانية. ثم انقر على نفس الزر لوقف المحاكاة ومواصلة التسجيل لمدة 60 ثانية.
استخدام برنامج مخصص MATLAB المستندة إلى قطاع واستخراج مختلف إمكانات الحقل والعمل المعلمات البيانات المحتملة. أولا ، تشغيل شفرة تحليل الموجي وانقر على ملف وحدد Process.h5. البحث عن وتحديد mwd التي تم إنشاؤها سابقا.
h5 ملف. انقر فوق الزر "حفظ الدليل" لتغيير موقع التخزين لملفات الإخراج. ثم إنشاء قائمة انتظار معالجة إشارة عن طريق تحديد القطب ومجموعات جيدا من الفائدة ومن ثم النقر فوق زر قائمة الانتظار.
كرر هذه الخطوة لإضافة المزيد من الأقطاب الكهربائية وتركيبات البئر إلى قائمة الانتظار. إذا تم علاج الخلايا بالعقاقير، يمكن تحرير قائمة الانتظار عن طريق النقر مباشرة على اسم ميد، ميد تركيز. بمجرد الانتهاء من قائمة الانتظار، انقر فوق الزر تهيئة الطول الموجي، الذي سيبدأ المعالجة الأولية حيث يتم تحديد الإشارات واستخراجها للتجزئة.
عند الانتهاء من المعالجة، انقر على الزر تكبير، وحدد إمكانية الإجراء، أو منطقة AP، التي تهمك. انقر على الزر الاحتفاظ، ثم راجع اللوحات. يتم الكشف عن القمم وأحواض لكل شكل موجي، ويتم فرضها على APs تطبيع.
عند الانتهاء، انقر فوق الزر Keep للانتقال إلى التتبع التالي في قائمة الانتظار، وكرر العملية لبقية الأقطاب الكهربائية وإشارات التركيبة جيداً. إن قابلية البقاء وكثافة الطلاء في عضلة القلب بعد ذوبانها أمر بالغ الأهمية لثقافة MEA متعددة الويل. ويؤدي الطلاء السليم إلى ثقافة أحادية الطبقة صحية مع الضرب العفوي في 48 ساعة، في حين أن ضعف قدرة الخلية على البقاء يؤدي إلى ثقافات ذات نسبة عالية من السكان غير الميوسيتيين.
يؤثر تشتت قطرات الخلية على كثافة الثقافة ويمكن أن يؤدي حتى إلى موت الخلايا ، لذلك من المهم وضع الخلايا الدقيقة. تخضع الخلايا المستزرعة على الاتفاقات المتعددة الثقافات لفحص جودة النشاط الكهربائي بعد 48 ساعة من الطلاء. إذا كان 50٪ من الأقطاب الكهربائية داخل شبكة و 70٪ من إجمالي الشبكات لا تنتج إشارات FP ، فإن الثقافة هي دون المستوى الأمثل.
يمكن الحصول على تسجيلات AP بوساطة كهربائية عدة مرات 48 ساعة بعد طلاء MEA. لم يكن للكهربة المتعددة لنفس موقع الخلية عند الصفر، 24، 48، 72، و96 ساعة أي تأثير كبير على شكل AP بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم ملاحظة أي ارتباط بين FP و بعد السعة الكهربائية AP من نفس موقع الخلية.
ميزة هامة من هذا الأسلوب هو أن لوحة MEA متعددة المستويات يمكن إعادة استخدامها عدة مرات. وللتدليل على موثوقية هذه المصفوفة، يتم سحب الطول الموجي 3,815 AP من ثلاث دفعات استعادة، ويتم استخراج بيانات مدة AP لفحص تكرار النتائج. عندما تكون ذات فائدة ، فمن الممكن إجراء فحوصات إضافية ، مثل التعبير الجيني ، وقياسات الكالسيوم العابرة وتشبك التصحيح للتحقيق في سلوك التيارات الأيونية المحددة.
هذه التقنية تمهد الطريق للباحثين لتعزيز النضج الكهربائي وكذلك لفحص آثار الجرعة المزمنة على عضلة القلب.
