Das folgende Protokoll beschreibt die Entwicklung von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozytennetzwerken auf Multiwell-MEA-Platten, um die Zellmembranen für Aktionspotenzialmessungen reversibel zu elektroporatieren. Aktionspotentialparameter können dann verwendet werden, um diese Reaktionskurven zu Testverbindungen für die Elektrophysiologie zu erzeugen. Multiwell MEA Codierung und Zellbeschichtung sind die anspruchsvollsten Schritte, die besondere Aufmerksamkeit erfordern.
Man muss diese Schritte sorgfältig und schnell durchführen, um zu verhindern, dass sich Tröpfchen ausbreiten und austrocknen. Mit der Praxis kann dies leicht überwunden werden. Wir haben eine benutzerdefinierte grafische Benutzeroberfläche für Einzelsegmentierung, Qualitätssicherung und Parameterextraktion entwickelt.
Unser robuster MATLAB-Workflow wurde implementiert, um große Mengen an rohen experimentellen Daten schnell in eine unvoreingenommene Gruppierung potenzieller Wellenformen zu reduzieren. Beginnen Sie mit dem Auftauen von vom Menschen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten gemäß Manuskriptanweisungen. Unterbrechen Sie die Zellen vorsichtig mit einer Transferpipette, um Zellklumpen zu dissoziieren.
Dann vorsichtig zwei Milliliter Zellsuspension in jeden Brunnen einer substratbeschichteten Sechs-Brunnen-Platte geben und die Platte in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid platzieren. Zellen sollten sich 24 Stunden an die Geltrakte halten und spontan bei 48 Stunden nach der Beschichtung schlagen. Zwei Tage vor der Beschichtung fügen Sie 0,5 Milliliter menschliches iPSC-Kardiomyozytenkulturmedium zu jedem Brunnen eines 24-Well-Multielektroden-Arrays oder einer MEA-Platte hinzu und führen eine Basisaufzeichnung durch, um das Signal-Rausch-Verhältnis als Qualitätsprüfung der MEAs zu überprüfen.
Dann die Medien ansaugen, die Brunnen mit sterilem Wasser abspülen und unter UV-Licht in einer laminaren Strömungshaube über Nacht sterilisieren. Am nächsten Tag 0,1 Milliliter FBS zu jedem Brunnen für die hydrophile Behandlung von MEA-Oberflächen hinzufügen und die Platte bei Raumtemperatur für 30 Minuten inkubieren. Dann die FBS ansaugen und jeden Brunnen zweimal mit 0,5 Milliliter nsterilem Wasser abspülen.
Lassen Sie die Platte über Nacht in der laminaren Strömungshaube trocknen. Am nächsten Tag, Pipette fünf Mikroliter der arbeitenden Fibronectin Verdünnung und sorgfältig das Tröpfchen in der Mitte jedes Brunnens, um alle 12 Elektroden zu decken. Legen Sie die Platte sofort auf eine erhöhte Oberfläche in eine Befeuchtungskammer, die genügend steriles Wasser enthält, um die gesamte Telleroberfläche zu bedecken.
Legen Sie die Kammer mit der Platte drei Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator und fahren Sie dann mit der Zellbeschichtung fort. Wenn Sie bereit sind, die Kardiomyozyten zu verplatten, passen Sie die Zelldichte auf 6.000 Zellen pro Mikroliter an, indem Sie sie im menschlichen iPSC-Kardiomyozytenauftaumedium verdünnen. Verwenden Sie sanftes Flicken, um die Zellen vor Sedimenten zu bewahren.
Bringen Sie die MEA-Platte in die laminare Strömungshaube und entfernen Sie vorsichtig den Fibronectin-Tropfen mit einer P10-Pipette, ohne die Elektroden zu berühren. Geben Sie sofort ein Fünf-Mikroliter-Zelltröpfchen in die Mitte des Brunnens und stellen Sie sicher, dass alle 12 Elektroden abgedeckt sind. Tun Sie dies gut zu einer Zeit, um zu verhindern, dass Fibronectin austrocknet.
Nach der Beschichtung die MEA-Platte wieder in die lose abgedeckte Befeuchtungskammer legen und für drei Stunden an den Zellkultur-Inkubator zurückgeben. Verwenden Sie nach der Inkubation eine P200-Pipette, um sorgfältig 200 Mikroliter menschliches iPSC-Kardiomyozytenauftaumedium zu jedem Brunnen hinzuzufügen, ohne die Zellen zu stören. Legen Sie die MEA-Platte wieder in den Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie kulturmedium 24 Stunden nach der Beschichtung.
Wenn Sie bereit sind, Signal von den Kardiomyozyten zu erfassen, initiieren Sie die Erfassungssoftware und legen Sie die MEA-Platte gemäß Manuskriptanweisungen ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erkunden, um das Signal in allen Brunnen zu visualisieren und die Signalqualität in stationären Zustandsbedingungen zu überprüfen. Notieren Sie sich Elektroden mit Feldpotential oder FP-Signalen im Millivolt-Bereich.
Klicken Sie dann auf dieselbe Schaltfläche, um die Erkundung zu beenden. Bisher wurden keine Daten erfasst. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Gehen", um mit der Aufnahme zu beginnen.
Die Elektroden in jedem Brunnen zeigen FP-Signale im Rohdatenfenster an. Nach 30 Sekunden aufnahmeweise auf die Schaltfläche Stimulieren klicken und 30 Sekunden lang die Elektroporation an den ausgewählten Stellen zulassen. Klicken Sie dann auf dieselbe Schaltfläche, um die Simulation zu beenden und die Aufnahme für 60 Sekunden fortzusetzen.
Verwenden Sie die MATLAB-basierte benutzerdefinierte Software, um verschiedene Feldpotenzial- und Aktionspotenzial-Datenparameter zu segmentieren und zu extrahieren. Führen Sie zunächst den Wellenformanalysecode aus, und klicken Sie auf Datei, und wählen Sie Process.h5 aus. Suchen und wählen Sie den zuvor erstellten mwd aus.
h5-Datei. Klicken Sie auf die Schaltfläche Verzeichnis speichern, um den Speicherort der Ausgabedateien zu ändern. Erstellen Sie dann eine Signalverarbeitungswarteschlange, indem Sie die von Interesse entfernte Elektrode und Brunnenkombinationen auswählen und dann auf die Schaltfläche Warteschlange klicken.
Wiederholen Sie diesen Schritt, um der Warteschlange weitere Elektroden- und Brunnenkombinationen hinzuzufügen. Wenn Zellen mit Medikamenten behandelt wurden, kann die Warteschlange bearbeitet werden, indem Sie direkt auf Med Name, Med Concentration klicken. Sobald die Warteschlange abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Wellenformen initialisieren, die die vorläufige Verarbeitung startet, bei der die Signale identifiziert und für die Segmentierung extrahiert werden.
Wenn die Verarbeitung abgeschlossen ist, klicken Sie auf die Schaltfläche Zoom In, und wählen Sie das Aktionspotenzial oder den AP-Bereich aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Behalten, und überprüfen Sie die Bedienfelder. Die Spitzen und Tiefen werden für jede Wellenform erkannt, und die normalisierten APs werden überlagert.
Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Beibehalten, um zur nächsten Spur in der Warteschlange zu wechseln, und wiederholen Sie den Vorgang für den Rest der Elektrode und die Well-Kombinationssignale. Die Lebensfähigkeit und Beschichtungsdichte der postgetauten Kardiomyozyten ist entscheidend für die Multiwell-MEA-Kultur. Richtige Beschichtung führt zu einer gesunden Monolayer-Kultur mit spontanem Schlagen bei 48 Stunden, während schlechte Zelllebensfähigkeit in Kulturen mit einem hohen Anteil an Nicht-Myozyten-Populationen resultiert.
Die Zelltröpfung beeinflusst die Kulturdichte und kann sogar zum Zelltod führen, daher ist eine präzise Zellplatzierung wichtig. Die auf MEAs kultivierten Zellen werden 48 Stunden nach der Beschichtung einer Qualitätsprüfung auf elektrische Aktivität unterzogen. Wenn 50 % der Elektroden innerhalb eines Netzwerks und 70 % der gesamten Netze keine FP-Signale erzeugen, ist die Kultur suboptimal.
Elektroporation vermittelte AP-Aufnahmen können mehrmals 48 Stunden nach MEA-Beschichtung erhalten werden. Mehrere Elektroporationen der gleichen Zellstelle bei Null, 24, 48, 72 und 96 Stunden haben keinen signifikanten Einfluss auf die AP-Form im Laufe der Zeit. Darüber hinaus wurde keine Korrelation zwischen FP- und Post-Elektroporation-AP-Amplituden von derselben Zellstelle beobachtet.
Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist, dass die Multiwell-MEA-Platte mehrfach wiederverwendet werden kann. Um die Zuverlässigkeit dieses Arrays zu demonstrieren, werden 3, 815 AP-Wellenformen aus drei Wiederherstellungsbatches gezogen, und AP-Dauerdaten werden extrahiert, um die Wiederholbarkeit der Ergebnisse zu untersuchen. Wenn von Interesse, ist es möglich, zusätzliche Assays durchzuführen, wie Genexpression, Kalzium transiente Messungen und Patch Klemme, um das Verhalten bestimmter ionenischer Ströme zu untersuchen.
Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die elektrophysiologische Reifung zu verbessern sowie chronische Dosiseffekte auf Kardiomyozyten zu überprüfen.
