Следующий протокол описывает развитие человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных кардиомиоцитов сетей на многоуэлльных пластин MEA обратить вспять электропорат клеточных мембран для действий потенциальных измерений. Потенциальные параметры действия могут быть использованы для генерации этих кривых реакции для тестирования соединений для электрофизиологии. Multiwell MEA кодирования и сотового покрытия являются наиболее сложными шагами, которые нуждаются в особом внимании.
Необходимо выполнять эти шаги старательно и быстро, чтобы предотвратить распространение и высыхание капель. С практикой, это может быть легко преодолеть. Мы разработали пользовательский графический пользовательский интерфейс для одной сегментации, обеспечения качества и извлечения параметров.
Наш надежный рабочий процесс MATLAB был реализован для быстрого сокращения больших объемов необработанных экспериментальных данных в объективную группировку потенциальных волновых форм действия. Начните с оттаивания человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток полученных кардиомиоцитов в соответствии с рукописными направлениями. Аккуратно приостанавливайте работу клеток с помощью переносной пипетки для разобщения клеточных комков.
Затем тщательно обойтись два миллилитров клеточной подвески в каждый колодец субстрат покрытием шесть хорошо пластины и поместить пластину в инкубатор культуры клеток на 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа. Клетки должны придерживаться гелевых путей в течение 24 часов и бить спонтанно в 48 часов после покрытия. За два дня до покрытия добавить 0,5 миллилитра человека iPSC кардиомиоцитов культуры среды к каждому хорошо 24-хорошо мульти-электрод массива, или MEA пластины, и выполнить базовую запись для проверки соотношения сигнала к шуму в качестве проверки качества MEAs.
Затем, аспирировать средства массовой информации, промыть колодцы стерильной водой, и стерилизовать под ультрафиолетовым светом в ламинарном капюшоне потока на ночь. На следующий день добавьте 0,1 миллилитров FBS к каждой пластине для гидрофильной обработки поверхностей МЭА и инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем аспирировать FBS, и промыть каждый хорошо дважды с 0,5 миллилитров стерильной воды.
Оставьте тарелку высохнуть в ламинарный капюшон потока на ночь. На следующий день пипетка пять микролитров рабочего фибронектина разбавления и тщательно обойтись капли в центре каждой хорошо, чтобы покрыть все 12 электродов. Немедленно поместите тарелку на поднятую поверхность внутри увлажняющей камеры, содержащей достаточно стерильной воды, чтобы покрыть всю поверхность блюда.
Поместите камеру с пластиной в инкубатор культуры клеток в течение трех часов, а затем приступить к ячейке покрытие. Когда вы будете готовы к пластине кардиомиоцитов, настроить плотность клеток до 6000 клеток на микролитер, разбавляя их в организме человека iPSC кардиомиоцитов оттаивания среды. Используйте нежный стряхивая держать клетки от осадков.
Принесите пластину MEA в капот ламинарного потока и тщательно удалите фибронектин капли с P10 пипетки, не касаясь электродов. Немедленно обойтись пятимикролитровой клеточной капли в центр хорошо убедившись, чтобы покрыть все 12 электродов. Сделайте это один хорошо в то время, чтобы предотвратить фибронектин от высыхания.
Когда закончите покрытие, поместите пластину MEA обратно в свободно покрытой увлажняющей камере и вернуть его в инкубатор культуры клеток в течение трех часов. После инкубации используйте пипетку P200, чтобы тщательно добавить 200 микролитров сердечно-солнечных среду iPSC-микромиоцитов к каждому хорошо, не нарушая клетки. Поместите пластину MEA обратно в инкубатор культуры клеток и замените культурную среду через 24 часа после покрытия.
Когда вы будете готовы получить сигнал от кардиомиоцитов, инициировать приобретение программного обеспечения и вставить пластину MEA в соответствии с рукописными указаниями. Нажмите кнопку Explore, чтобы визуализировать сигнал во всех скважинах и проверить качество сигнала в стабильных условиях состояния. Заметим об электродах с полевым потенциалом, или FP, сигналах в диапазоне милливольт.
Затем нажмите ту же кнопку, чтобы остановить разведку. До настоящего времени данные не были зарегистрированы. Нажмите кнопку Перейти, чтобы начать запись.
Электроды в каждой колодец будут показывать сигналы FP в окне необработанных данных. После 30 секунд записи нажмите на кнопку Стимулирование и позвольте электропорации иметь место на выбранных участках в течение 30 секунд. Затем нажмите на ту же кнопку, чтобы остановить моделирование и продолжить запись в течение 60 секунд.
Используйте пользовательское программное обеспечение на основе MATLAB для сегментации и извлечения различных параметров потенциальных и потенциальных данных на местах. Во-первых, запустите код анализа волновой формы и нажмите на файл и выберите Process.h5. Найти и выбрать ранее созданный mwd.
h5 файл. Нажмите на кнопку «Сохранить каталог», чтобы изменить расположение хранилища выходных файлов. Затем создайте очередь обработки сигнала, выбрав электрод и хорошо комбинации интересов, а затем нажав кнопку Очереди.
Повторите этот шаг, чтобы добавить больше электродов и комбинаций хорошо в очереди. Если клетки лечились с помощью лекарств, очередь может быть отредактирована, нажав непосредственно на Med Name, Med Concentration. Как только очередь будет завершена, нажмите кнопку Initialize Waveforms, которая запустит предварительную обработку, где сигналы идентифицируются и извлекаются для сегментации.
Когда обработка закончена, нажмите на кнопку Увеличить в, и выбрать потенциал действий, или AP, область интереса. Нажмите кнопку Keep и просмотрите панели. Пики и желоба обнаруживаются для каждой формы волны, а нормализованные АП накладываются.
После завершения, нажмите кнопку Хранить, чтобы перейти к следующему следу в очереди, и повторить процесс для остальной части электрода и хорошо комбинированных сигналов. Жизнеспособность и плотность покрытия посттаятых кардиомиоцитов имеет решающее значение для мультиуэлл-культуры MEA. Правильное покрытие приводит к здоровой культуре монослой с спонтанным избиением в 48 часов, в то время как плохая жизнеспособность клеток приводит к культурам с высоким процентом немиоцитов населения.
Дисперсия капель клеток влияет на плотность культуры и может даже привести к гибели клеток, поэтому точное размещение клеток имеет важное значение. Клетки, обувядющиеся на МЕА, подвергаются проверке качества электрической активности через 48 часов после покрытия. Если 50% электродов в сети и 70% от общего числа сетей не производят сигналы FP, то культура является неоптимальной.
Электропорация опосредовано AP записи могут быть получены несколько раз 48 часов после MEA покрытие. Множественные электропорации одного и того же участка ячейки на нуле, 24, 48, 72 и 96 часов не имеют существенного влияния на форму AP с течением времени. Кроме того, не наблюдалось никакой корреляции между FP и амплитудой AP после электропорации с одного и того же места ячейки.
Существенным преимуществом этого метода является то, что многоявленная пластина MEA может быть повторно использована несколько раз. Чтобы продемонстрировать надежность этого массива, 3, 815 AP волновые формы вытащил из трех пакетов восстановления, и AP продолжительность данных извлекается для изучения повторяемости результатов. При интересе, можно выполнить дополнительные анализы, такие как экспрессия генов, кальций переходных измерений и патч зажим для исследования поведения конкретных ионных течений.
Этот метод прокладывает путь для исследователей для повышения электрофизиологического созревания, а также для проверки хронического воздействия дозы на кардиомиоциты.
