以下のプロトコルは、マルチウェルMEAプレート上でヒトが誘導する多能性幹細胞由来心筋細胞ネットワークの開発を説明し、作用電位測定のために細胞膜を可逆的に電気ポポレートする。作用電位パラメータは、これらの応答曲線を生成して、電気生理学用の化合物をテストするために使用することができます。マルチウェルMEAコーディングとセルめっきは、特別な注意が必要な最も困難なステップです。
液滴の拡散と乾燥を防ぐために、これらのステップを熱心かつ迅速に実行する必要があります。練習すれば、これは簡単に克服できます。我々は、単一のセグメンテーション、品質保証とパラメータ抽出のためのカスタムグラフィカルユーザーインターフェースを開発しました。
当社の堅牢なMATLABワークフローは、大量の生実験データを、アクション電位波形の公平なグループ化に迅速に削減するために実装されました。原稿の指示に従って、ヒトによる多能性幹細胞由来心筋細胞の解凍から始めます。移管ピペットを使用して細胞を穏やかに中断し、細胞の塊を解化します。
その後、慎重に基板コーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液の2ミリリットルを分配し、37°Cと5%の二酸化炭素で細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。細胞はゲルの区域に24時間付着し、48時間のめっき後に自発的に打ち負かすべきである。めっきの2日前には、ヒトiPSC心筋細胞培養培地を24ウェル多極アレイ(MEAプレート)の各ウェルに0.5ミリリットル添加し、ベースライン記録を行い、MEAの品質チェックとして信号対雑音比を検証する。
その後、培地を吸引し、滅菌水でウェルをすすい、一晩の層流フードでUV光の下で滅菌する。翌日、MEA表面の親水性処理のために各ウェルに0.1ミリリットルのFBSを加え、室温でプレートを30分間インキュベートします。その後、FBSを吸引し、各ウェルを0.5ミリリットルの無菌水で2回リンスします。
プレートをラミナーフローフードで一晩乾燥させます。翌日、5マイクロリットルの働くフィブロネクチン希釈液をピペットし、12個の電極すべてをカバーするために各ウェルの中央に液滴を慎重に分配します。皿表面全体を覆うのに十分な無菌水を含む加湿チャンバーの中の上げられた表面にすぐに皿を置く。
チャンバーをプレートとともに細胞培養インキュベーターに3時間置き、次いで細胞めっきを進めます。心筋細胞をプレートする準備ができたら、ヒトiPSC心筋細胞解凍培地で希釈して、細胞密度をマイクロリットル当たり6,000個の細胞に調整します。細胞を沈めないように、穏やかなフリックを使用してください。
MEAプレートを層流フードに持ち込み、電極に触れることなくP10ピペットでフィブロネクチンのドロップを慎重に取り除きます。すぐに5マイクロリットルのセル液滴をウェルの中央に分配し、12個の電極すべてをカバーすることを確認します。フィブロネクチンの乾燥を防ぐために、これを一度に1つずつよく行います。
めっきが終わったら、ゆるやかに覆われた加湿チャンバーにMEAプレートを戻し、細胞培養インキュベーターに3時間戻します。インキュベーション後、P200ピペットを使用して、細胞を邪魔することなく、ヒトiPSC心筋細胞解凍培地を200マイクロリットルずつ慎重に添加します。MEAプレートを細胞培養インキュベーターに戻し、めっき後24時間培養液を交換する。
心筋細胞から信号を取得する準備ができたら、取得ソフトウェアを開始し、原稿の指示に従ってMEAプレートを挿入します。[探索]ボタンをクリックすると、すべてのウェルで信号が可視化され、定常状態の信号品質を確認できます。ミリボルト範囲の電位(FP)を持つ電極に注意を付けます。
次に、同じボタンをクリックして探索を停止します。この時点までデータは記録されていません。[移動] ボタンをクリックして、記録を開始します。
各ウェルの電極は、生データウィンドウにFP信号を表示します。30秒の記録後、刺激ボタンをクリックし、選択した場所で30秒間エレクトロポレーションを行います。その後、同じボタンをクリックしてシミュレーションを停止し、60秒間録画を続けます。
MATLAB ベースのカスタム ソフトウェアを使用して、さまざまなフィールドポテンシャルおよびアクションポテンシャル データ パラメータをセグメント化して抽出します。まず、波形解析コードを実行し、[ファイル]をクリックして[Process.h5]を選択します。以前に作成した mwd を検索して選択します。
h5 ファイル。[ディレクトリの保存] ボタンをクリックして、出力ファイルの保存場所を変更します。次に、目的の電極とウェルの組み合わせを選択し、[キュー]ボタンをクリックして、信号処理キューを作成します。
この手順を繰り返して、より多くの電極とウェルの組み合わせをキューに追加します。細胞が薬物で治療された場合、キューはメドネーム、メド濃度を直接クリックして編集することができます。キューが確定したら、[波形の初期化]ボタンをクリックすると、信号が識別され、セグメンテーションのために抽出される予備処理が開始されます。
処理が完了したら、[ズームイン]ボタンをクリックし、対象となるアクションポテンシャル(AP)を選択します。[保持] ボタンをクリックし、パネルを確認します。ピークとトラフは、すべての波形に対して検出され、正規化された AP は重ね合わされます。
完了したら、[Keep](キープ)ボタンをクリックしてキュー内の次のトレースに進み、残りの電極とウェルコンビネーション信号のプロセスを繰り返します。解凍後の心筋細胞の生存率とめっき密度は、マルチウェルMEA培養にとって重要です。適切なめっきは48時間で自発的な殴打を伴う健康的な単層培養をもたらし、細胞生存率が悪いと非ミオサイト集団の割合が高い培養物が生じる。
細胞液滴分散は培養密度に影響を及ぼし、細胞死にもつながり得るので、細胞の正確な配置が重要です。MEA上で培養した細胞は、めっき後48時間後に電気活性の品質チェックを受ける。ネットワーク内の電極の50%、ネットワーク全体の70%がFP信号を生成しない場合、培養は最適ではない。
エレクトロポレーション媒介AP記録は、MEAめっき後48時間複数回得ることができる。同じセル部位の複数のエレクトロポレーションは、0、24、48、72、および96時間で、時間の経過と同時にAP形状に大きな影響を与える。さらに、FPと同じセル部位からのポストエレクトロポレーションAP振幅との間に相関は認められていない。
この方法の大きな利点は、マルチウェルMEAプレートを複数回再利用できることです。このアレイの信頼性を実証するために、3,815 AP波形が3つの復元バッチから引き出され、AP期間データが抽出され、結果の再現性を調べます。目的の場合、遺伝子発現、カルシウム過渡性測定、パッチクランプなどの追加アッセイを実行して、特定のイオン電流の挙動を調べることができます。
この技術は、研究者が電気生理学的成熟を強化するだけでなく、心筋細胞に対する慢性的な用量効果をスクリーニングする道を開きます。
