הפרוטוקול הבא מתאר את ההתפתחות של רשתות קרדיומיוציטים המושרות על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם על לוחות MEA מרובי חלקים כדי להפוך את ממברנות התא למדידות פוטנציאליות לפעולה. פרמטרים פוטנציאליים פעולה לאחר מכן ניתן להשתמש כדי ליצור עקומות תגובה אלה כדי לבדוק תרכובות עבור אלקטרופיזיולוגיה. קידוד MEA רב-וואל וציפוי תאים הם הצעדים המאתגרים ביותר הזקוקים לתשומת לב מיוחדת.
יש לבצע צעדים אלה בחריצות ובהירות כדי למנוע טיפות מתפשטות ומתייבשות. עם תרגול, זה יכול להיות להתגבר בקלות. פיתחנו ממשק משתמש גרפי מותאם אישית עבור פילוח יחיד, אבטחת איכות והפקת פרמטרים.
זרימת העבודה החזקה שלנו של MATLAB יושמה כדי להפחית במהירות כמויות גדולות של נתונים ניסיוניים גולמיים לקבוצה בלתי משוחדת של צורות גל פוטנציאליות לפעולה. התחל בהפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי בני אדם על ידי קרדיומיוציטים על פי הוראות כתב היד. להשעות בעדינות את התאים באמצעות פיפטה העברה כדי לנטרל גושי תאים.
לאחר מכן מחלקים בזהירות שני מיליליטר של השעיית תאים לתוך כל באר של צלחת שש באר מצופה מצעים ומנחים את הצלחת באינקובטור של תרבות התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. תאים צריכים לדבוק בדרכי הג'ל על ידי 24 שעות והיכו באופן ספונטני ב 48 שעות לאחר ציפוי. יומיים לפני הציפוי להוסיף 0.5 מיליליטר של תאוות קרדיומיוציטים iPSC אנושי בינוני לכל באר של מערך רב אלקטרודה 24 היטב, או צלחת MEA, ולבצע הקלטה בסיסית כדי לאמת את יחס אות לרעש כבדיקה איכותית של MEAs.
לאחר מכן, שאפו את התקשורת, שטפו את בארות במים סטריליים, וערקו תחת אור UV במכסה המנוע של זרימה למינארית בן לילה. למחרת, להוסיף 0.1 מיליליטר של FBS לכל באר לטיפול הידרופילי של משטחי MEA הדגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לאחר מכן שאפו את ה- FBS, ושטוף כל באר פעמיים עם 0.5 מיליליטר של מים סטריליים.
השאירו את הצלחת להתייבש במכסה המנוע לזרימת למינאר לילה. ביום שלמחרת, פיפטה חמישה microliters של דילול fibronectin עובד בזהירות לחלק את טיפה במרכז כל באר כדי לכסות את כל 12 אלקטרודות. מיד מניחים את הצלחת על משטח מוגבה בתוך תא לח המכיל מספיק מים סטריליים כדי לכסות את משטח המנה כולו.
מניחים את התא עם הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך שלוש שעות ולאחר מכן להמשיך עם ציפוי התא. כאשר מוכן צלחת cardiomyocytes, להתאים את צפיפות התא ל 6, 000 תאים לכל microliter על ידי דילול אותם במדיום הפשרת iPSC אנושי. השתמש בהצלבה עדינה כדי למנוע מהתאים לטפטף.
הביאו את צלחת ה- MEA למכסה המנוע של הזרימה למינאר והסירו בזהירות את טיפת הפיברונקין עם פיפטה P10 מבלי לגעת באלקטרודות. מחלקים מיד טיפת תא חמישה מיקרוליטר למרכז הבאר ומוודאים לכסות את כל 12 האלקטרודות. לעשות את זה טוב בכל פעם כדי למנוע פיברונקין ייבוש.
לאחר סיום הציפוי, מניחים את צלחת MEA בחזרה בתא הלחות המפויח באופן רופף ומחזירים אותו לחממת תרבות התא במשך שלוש שעות. לאחר הדגירה, השתמש פיפטה P200 להוסיף בזהירות 200 microliters של אדם iPSC קרדיומיוציט הפשרת בינוני לכל באר מבלי להפריע לתאים. מניחים את צלחת MEA בחזרה באינקובטור תרבות התא ולהחליף תרבות בינונית 24 שעות לאחר הציפוי.
כאשר מוכן לרכוש אות מן cardiomyocytes, ליזום את תוכנת הרכישה ולהכניס את לוח MEA על פי הוראות כתב היד. לחץ על לחצן סייר כדי להמחיש את האות בכל הבארים ולאמת את איכות האות בתנאי מצב יציבים. רשום הערות על אלקטרודות עם פוטנציאל שדה, או FP, אותות בטווח המילי-וולט.
לאחר מכן לחץ על אותו לחצן כדי לעצור את המחקר. עד לנקודה זו לא נרשמו נתונים. לחץ על לחצן עבור כדי להתחיל בהקלטה.
האלקטרודות בכל באר יראה אותות FP בחלון הנתונים הגולמיים. לאחר 30 שניות של הקלטה, לחץ על כפתור Stimulate ולאפשר electroporation להתקיים באתרים שנבחרו במשך 30 שניות. לאחר מכן לחץ על אותו כפתור כדי לעצור את הסימולציה ולהמשיך להקליט במשך 60 שניות.
השתמש בתוכנה המותאמת אישית המבוססת על MATLAB כדי למקטע ולחלץ פרמטרי נתונים פוטנציאליים שונים של פוטנציאל שדה ופעולה. תחילה, הפעל את קוד ניתוח צורת הגל ולחץ על קובץ ובחר Process.h5. חפש ובחר את ה- mwd שנוצר קודם לכן.
h5 קובץ. לחץ על לחצן שמור ספריה כדי לשנות את מיקום האחסון של קבצי הפלט. לאחר מכן צור תור עיבוד אותות על-ידי בחירת האלקטרודה ושילובי עניין טובים ולאחר מכן לחיצה על לחצן תור.
חזור על שלב זה כדי להוסיף אלקטרודה נוספת ושילובים טובים לתור. אם התאים טופלו בסמים, ניתן לערוך את התור על ידי לחיצה ישירה על שם Med, Med Concentration. לאחר שהתור יושלם, לחץ על לחצן אתחל צורות גל, שיתחיל את העיבוד הראשוני שבו האותות מזוהים ומופקים עבור פילוח.
בסיום העיבוד, לחצו על הלחצן 'התקרבות', ובחרו את פוטנציאל הפעולה, או AP, אזור מעניין. לחצו על הלחצן 'שמור' וסקורו את החלניות. הפסגות והשוקת מזוהות עבור כל צורת גל, וה- APs המנורמלים נמצאים על-אף.
לאחר שתסיים, לחץ על לחצן שמור כדי לעבור למעקב הבא בתור, וחזור על התהליך עבור שאר האותות האלקטרודה והשילוב היטב. הכדאיות וצפיפות ציפוי של cardiomyocytes שלאחר מופשר הוא קריטי עבור תרבות MEA רב-שכבתית. ציפוי נכון גורם לתרבות מונוליאר בריאה עם מכות ספונטניות ב 48 שעות, בעוד הכדאיות התא עניים תוצאות תרבויות עם אחוז גבוה של אוכלוסיות שאינן myocyte.
פיזור טיפת תא משפיע על צפיפות התרבות והוא יכול אפילו להוביל למוות של תאים, ולכן מיקום תאים מדויק חשוב. התאים בתרבות על MEAs כפופים לבדיקה איכותית של פעילות חשמלית 48 שעות לאחר הציפוי. אם 50% מהאלקטרודות ברשת ו-70% מכלל הרשתות אינן מייצרות אותות FP, התרבות תת-אופטימלית.
ניתן להשיג הקלטות AP מתווכים אלקטרופורציה מספר פעמים 48 שעות לאחר ציפוי MEA. אלקטרופורציה מרובה של אותו אתר תא באפס, 24, 48, 72 ו-96 שעות אין השפעה משמעותית על צורת AP לאורך זמן. בנוסף, לא נצפתה מתאם בין משרעת AP של FP לבין משרעת AP לאחר אלקטרופולציה מאותו אתר תא.
יתרון משמעותי של שיטה זו הוא כי צלחת MEA multiwell ניתן לעשות שימוש חוזר מספר פעמים. כדי להדגים את המהימנות של מערך זה, 3, 815 צורות גל AP נמשכות משלוש אצוות שחזור, ותווכי משך AP מופצים כדי לבחון את יכולת החזרה של התוצאות. כאשר עניין, ניתן לבצע בדיקות נוספות, כגון ביטוי גנים, מדידות סידן ארעי ומהדק תיקון כדי לחקור את ההתנהגות של זרמים יוניים ספציפיים.
טכניקה זו סוללת את הדרך עבור חוקרים כדי לשפר את ההבשלה האלקטרופיזיולוגית, כמו גם כדי לסנן השפעות מינון כרוני על cardiomyocytes.
