Çift DNA cetveli testi ribozom translokasyonu için mekanistik kavrayışlar sağlayabilir ve diğer nükleik asit yer değiştirmelerini inceleyebilir. Çift DNA cetveli testimiz şu anda ribozom komplekslerinde mRNA'nın giriş ve çıkış kenarlarını tek nükleotit çözünürlüğü ile objektif olarak inceleyebilen tek yöntemdir. Benzer yöntemler de DNA bağlama gücü ve keforik ilaçların seçiciliğini ölçmek için uygulanır.
Yöntemin görsel gösterimi, tekniğimizin avantajlarını sezgisel olarak göstermemiz ve diğer araştırmacıların daha fazla uygulamaya dönüştürmelerine yardımcı olmak için iyi bir şanstır. Başlamak için, iki milimetre üç milimetre üç milimetre boyutları ile merkezinde bir küp sondaj tarafından bir stiren şerit ile iyi bir plastik örnek olun. Daha sonra, epoksi kullanarak, alt yüzeye yaklaşık beş milimetre uzunluğunda biyotin kaplı cam bir parça tutkal.
Numune kuyusuna mililitre streptavidin sulu çözelti başına 0,25 miligram lık 20 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında 40 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra tam10 arabellek ile iki kez iyi yıkın. Antibiyotik olmadan ribozom kompleksleri immobilize etmek için, ilk iyi örnek tampon kaldırmak ve örnek kuyuya 0,1 mikromografi MF-Pre veya MF-Post ribozom kompleksi 20 mikrolitre ekleyin.
Bir saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın ve tam10 tamponuyla bir kez durulayın. Ribozom kompleksi şimdi mRNA beş-prime end biotin ile yüzeyde streptavidin ile bağlanır. Antibiyotik kullanarak deney için, dört milimolar neomisin bir mikrolitre ile MF-Pre kompleksinin dokuz mikrolitre kuluçka, 10 dakika boyunca 37 derece santigrat.
Sonra bir tüp 0.6 mikrolitre 60 mikrolitre, 0.8 mikrolitre 100 mikromolar GTP, 0.8 mikrolitre 100 milimolar PEP, 0.3 mililitre mililitre pirüferkiaz başına 1.3 mililitre, 6.43 mikrolitre TAM10 tampon ve beş milimolar fudik asit bir mikrolitre. 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yat. Sonra iki karışımı birleştirmek ve ek bir beş dakika için 37 santigrat derece kuluçka.
Benzer diğer antibiyotik deneyleri yürütmek, konsantrasyonları ile 0.2 milimolar viomisin, 0.4 milimoler higromisin B, ve 0.25 milimolar fusidik asit. Çerçeve kaydırma çalışması için, kaygan motifi içeren MFNF-Pre kompleksleri için kuluçka tekrarlayın, U6A. Fusidik asit artı neomisin antibiyotikler dahil.
Hibritleştirme sürecinin tamamlanmasını sağlamak için yeterli zaman gereklidir. Ayrıca homosteady bir sistem korumak için gerçek bir mol sodyum klorür ile TAM10 tampon kullanılması tavsiye edilir. Kuluçkadan sonra, arabelleği örnekten iyi çıkarın.
Bir mikromolar biyotinylated DNA iplikçik 20 mikrolitre ekleyin ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçka. Sabahları, oluşan DNA/mRNA dubleksini TAM10 tamponuyla bir kez durula. Arabelleği örnekten iyi çıkarın.
Daha sonra numuneye mililitre başına 0,5 miligram lık 20 mikrolitre streptavidin kaplı manyetik boncuk ekleyin ve iki saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, numuneyi dikkatlice bir tutucuya yerleştirin ve serbest manyetik parçacıkları yüzeyden beş dakika boyunca 84 kez g olarak çıkarmak için bir santrifüje yerleştirin. Lazeri aç.
Sonra güç düğmesine basın. Hassasiyeti 500 milivolta ayarlayın ve atomik manyetometreyi ısıtmak ve stabilize etmek için yaklaşık iki saat bekleyin. Atomik manyetometreyi ayarlamak için, enstrüman kontrol yazılımını çalıştırın ve Motor hareket modunu Gürültü ve varsayılan konumu sıfıra ayarlayın.
Ön panelde Kilit tuşuna basın. Hassasiyeti 200 milivolta ayarlayın. Lazerin akımını ve voltajını ayarlayın ve en iyi sinyal çözünürlüğü için uygun rezonans tepe noktasını ve sinyal-gürültü seviyesini bulun.
Ön panelde Sweep tuşuna basın. Genlik-genişlik oranının 0,5'in üzerinde olduğundan ve faz değerinin genişliği 170 hertz'den az olan beş dereceden daha küçük olduğundan emin olun. Frekansını kilitlemek için lazerin geri bildirimine başka bir SR530 kilitleme amplifikatörünün çıkışını takın.
Fiş fonksiyon jeneratör ATF20B zirveye 500 milivolt zirve bir kare dalga girişi, 100 milihertz manyetik sinyal akım dönüştürmek için referans sinyali olarak. Ardından işlev jeneratöründen fişi çekin. Motor hareket modunu 260 milimetreye iki yönlü ve varsayılan konuma ayarlayın.
Sıcaklık yaklaşık 37 santigrat derece, atomik sensör olduğundan emin olmak için sıcaklık kontrol durumu kontrol edin. Boş numune tutucunun sinyallerini ölçmek için numuneleri yüklemeden programı doğrudan çalıştırarak tüm sistemin stabilitesini iki kez kontrol edin. Örnekleri manyetize etmek için, numuneyi tutucudan çıkarmak için cımbızları yavaşça kullanın ve iki dakika boyunca manyetizasyon aşamasına yerleştirin.
Daha sonra numuneyi numune tutucuya geri koyun ve 20 dakika boyunca 335,4 kez g santrifüj edin. Özel olarak bağlı olmayan manyetik parçacıkları çıkarın. Bir sonraki yük numuneyi cımbızla motora yükleyin.
Programı çalıştırmak için ön panelde Kilitle'yi tıklatın. Bu arada tutucuya başka bir örnek yüklemek ve santrifüj içine yerleştirmek için cımbız kullanın. Kaplamalı cam tarafı santrifüjün ortasına doğru yapın ve santrifüje dört dakika boyunca 335,4 kez g'den başlayın.
Motor sıfıra geldiğinde, yaklaşık beş dakika sonra ön panelde Kaydet'i tıklatın. Motordan bir numuneyi santrifüj tutucuya aktarmak için cımbızları dikkatlice kullanın. Santrifüj hızını 100 rpm veya benzer bir adım boyutuyla artırarak daha güçlü bir kuvvet uygulayın.
Örneği santrifüjle değiştirin. Yavaş yavaş her zaman kuvvet artırmak için dönüşümlü olarak süreci. 10-12 veri noktasından sonra tam bir kuvvet spektrumu elde edilir.
Planlanan tüm denemeler tamamlandığında, ekipmanı kapatın ve açık olduğu gibi ters sırada devam edin. Numuneleri tutucudan çıkarın ve temizlik ve ileride kullanmak için etanoliçine batırın. Manyetik boncuk kontaminasyonu durumunda numune tutucuyu aseton ile temizleyin.
Bu protokolde, ribozom kompleksi mRNA'nın beş asal ucu üzerinden yüzeyde hareketsiz hale getirilmiş ve probing DNA cetvelleri için hem beş asal hem de üç asal tarafı kolayca erişilebilir hale getirmiştir. Beş asal tarafın bağlantı layıcısı 50 timinden daha uzun olduğunda, DNA/mRNA duplekslerinin başarılı bir şekilde oluşumunu gösteren güçlü bir manyetik sinyal saptandı. DNA'daki nükleotid lerin sayısı değiştirilerek, üç asal ve beş asal kenarlar için ayrışma kuvvetinin dupleks uzunluğuile korelasyonu sağlanmıştır.
MF-Pre'den MF-Post'a normal translokasyon sonuçları, antibiyotik yokluğunda, ribozomun her iki tarafta ki üç asal uca doğru üç nükleotit tarafından hareket ettiğini göstermektedir. MF-Pre, P ve A sitelerinde sırasıyla bir fMet-tRNA ve fenilalanin-tRNA taşırken, MF-Post sırasıyla E ve P sitelerinde fMet-tRNA ve fenilalanin-tRNA'yı boş bir A alanı ile taşımıştır. Ancak, hem fusidik asit hem de adiomisin antibiyotikleri mevcut olduğunda, ribozom beş asal tarafta sadece bir nükleotit, üç asal tarafta iki nükleotit tarafından hareket etti.
Antibiyotikler ipdikten sonra, normal translokasyon meydana geldi, hem beş-prime ve üç-prime tarafüç nükleotit hareketleri ile kanıtlanan. Numuneyi manyetize ederken, kaplamalı yüzey yaklaşmalı ve mıknatısı dikey olarak terk etmelidir. Ve özel olarak bağlı olmayan manyetik parçacıkların çıkarılması veri doğruluğu ve kalitesi için çok önemlidir.
Tekniğimiz, moleküler biyolojide yaygın olarak karşılaşılan nükleik asitin moleküler yer değiştirmesini araştırmak için yüksek çözünürlük ve genel olarak uygulanabilir bir yol sağlar.
