Farklı C perfringens toxinotypes için gıda örnekleri test etmek için kolay bir yöntem geliştirdik. Epsilon toksini üreten toksinotip B ve D'nin yaygınlığı ile özellikle ilgileniyoruz. Protokolümüz, anaerobik odacıklar veya sınırlı alt culturing ile kuvözler kullanmadan çeşitli C perfringens toxinotypes kolay zenginleşme ve algılama sağlar.
Bu yöntem aynı zamanda toprak, su, dışkı örnekleri ve daha fazla sınamak için kullanılabilir. Prosedürü gösteren Zuha Anwar ve Samantha Regan, laboratuvar teknisyenleri olacaktır. Modifiye hızlı perfringens orta veya RPM hazırlayarak başlayın.
El yazması talimatlara göre malzemeyi birleştirin ve karışımı 121 derecede 15 dakika otoklavlayın. Orta yaklaşık 40 santigrat derece soğumasını bekleyin, sonra litre başına 440 miligram son konsantrasyona D-sikloserin ekleyin. Aseptik 15 mililitrekonik tüpler için RPM aktarmak ve bir aya kadar dört derece santigrat de saklayın.
Kullanmadan önce ortayı 37 dereceye Kadar ısıtın. Test edilecek numuneleri toplarken, yiyecekleri el yazması talimatlara göre laboratuvara aktarın. Hemen test edilmezse, gıda eksi 20 santigrat derece saklanabilir.
Gıda türü ve menşe ülke yanı sıra diğer ilgili bilgileri not olun. Gıda test etmek için, steril bir Petri kabına yaklaşık bir ila iki gram aktarın ve steril bir jilet veya neşter ile ince ince kıyın. 15 mililitrelik konik bir tüpiçinde 10 mililitre PBS içine aşılayın ve iyice karıştırın.
PBS gıda karışımının beş mililitresini 10 mililitre RPM ile 15 mililitrelik konik bir tüpe aktararak ve kapağı sıkıca kapatarak bitkisel hücreler için seçin. 15 dakika boyunca 85 santigrat derece karışımıkalan beş mililitre ısıtarak sporlar için seçin. Ve sonra RPM ile bir tüp e nakletmek ve sıkıca kapağı nı kapatArak.
Tam karıştırma sağlamak için, girdap ve gıda RPM kültürleri ters. Daha sonra, sıkıca konik tüpler mühür ve anaerobik bir ortam yaratmak için parafin film ile kapakları sarın. Tüpleri bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve ertesi sabah herhangi bir bulanıklık veya fermantasyona dikkat edin.
Tryptose Sulfite Cycloserine veya TSC Agar üreticinin yönüne göre hazırlamak ve daha sonra gece RPM kültürleri ile aşılamak için sandviç tekniğini kullanın. Erimiş Agar'ın 10 mililitresini steril Petrie yemeklerine aktararak ve katılaşmasını sağlayarak tabakların taban tabakasını hazırlayın. Kalan TSC Agar'ı üst tabaka için 40 santigrat derecede koruyun ve bir gecede RPM kültürünün 100 mikrolitresini dikkatlice Agar üssüne aktarın.
Bazı kültürler fermantasyon nedeniyle baskı altında olabilir, bu nedenle tüm uygun kişisel koruyucu ekipman giymek emin olun. Steril cam boncuklar veya bir hücre yayıcı ile inoculine spread ve RPM 5 ila 10 dakika boyunca Agar içine emilir sağlar. Daha sonra, erimiş TSC Agar'ın 20 mililitresini dikkatlice plakaya aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.
Petrie çanak kapağını değiştirin ve TSC Agar'ın oda sıcaklığında tamamen katılamasını bekleyin, sonra yemeği ters çevirin ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Gerekirse, TSC Agar'a aşılamadan önce RPM kültürünün seri seyreltmelerini gerçekleştirin. Kuluçkadan sonra, bakteri üremesi için plakaları inceleyin.
Aerobik bakteriler Agar yüzeyinde mevcut olabilir, anaerobik bakteriler Agar gömülü olacak iken. Sülfit azaltıcı bakteriler çevredeki Agar'ı siyaha çevirecek ve olası C perfringens kolonileri siyah ve Agar'a gömülmüş olacak. Plaka yüzeyinde aerobik bakteri büyüme yoğun miktarda varsa, seçilen alanlardan kolonileri kaldırmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.
Şüpheli C perfringens kolonileri Agar koparmak için steril tek kullanımlık göz damlalığı kullanın, Önce Agar piercing hava çıkarmak için emin olun. 15 mililitrelik konik bir tüp içinde 10 mililitre taze RPM kolonileri aktarın. Aynı plakadan ayrı RPM kültürleri içine birden fazla koloni örneklenebilir.
Konik tüp kapaklarını sıkıca sabitleyin, parafin filmine sarın ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. C perfringens bir BSL iki organizmadır. Özellikle gecelik RPM kültürleri açarken her zaman uygun güvenlik önlemlerinin kullanılması ve kullanılmış ortamların dikkatlice dekontamine edilmesi ve bertaraf edilmesi önemlidir.
Ertesi gün, bir gecede kültürleri çıkarın ve bulanıklık ve fermantasyon için onları incelemek, sonra DNA çıkarma ile devam edin. Yavaşça herhangi bir yerleşmiş bakteri dağıtmak ve dikkatle tüp açmak için RPM kültürü ters. Bir mililitreyi mikrosentrifüj tüpüne aktarın ve bakterileri santrifüj le peletlayın.
Bir mililitre steril PBS ile peletyı yıkayın. Sindirilmemiş jelatin bakterilerin üstüne yerleşmiş ise, PBS ile ajitasyon tarafından kabartmak. Jelatin ve PBS'yi yavaşça aspire edin ve kalan bakteriyel peleti bir mililitre taze PBS ile yeniden askıya alın.
Bu hücre pelet sınırlı rahatsızlık ile herhangi bir peletli jelatin kaldırmak için önemlidir. Jelatinin çıkarılamaması DNA ekstraksiyonu ve PCR'yi inhibe edebilir. 10 dakika boyunca bakteri santrifüj ve dikkatle supernatant aspire.
Daha sonra gram pozitif bakteriler için özel olarak tasarlanmış bir kit kullanarak DNA ekstraksiyongerçekleştirin. DNA'yı hemen kullanın veya eksi 20 derecede saklayın. Kültürlerin C perfringens toxinotypes için pozitif olup olmadığını belirlemek için çıkarılan DNA PCR gerçekleştirin.
Tüm PCR reaktiflerinin çalıştığından emin olmak için C perfringens DNA'yı pozitif kontrol olarak kullanın. PCR'yi el yazması talimatlara göre çalıştırın ve agarose jel elektroforezile ürünleri analiz edin. Bu protokol, New York perakende mağazalarından satın alınan toplam 216 gıda numunesini test etmek için kullanılmıştır.
Örnekler arasında çeşitli et örnekleri, kümes hayvanları örnekleri ve deniz ürünleri örnekleri yer almaktadır. C perfringens Tip B pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Örneklenmiş gıdaların %15-20'sinin C perfringens testipozitif olduğu saptanmıştır.
34 pozitif örnekten 31'inde alfa toksin, bir örnekalfa, beta ve epsilon toksini içeriyordu. Ve iki örnek alfa ve epsilon toksini içeriyordu. Farklı C perfringens toxinotypes için gıda örnekleri test etmek için kolay bir yöntem geliştirdik.
Epsilon toksini üreten toksinotip B ve D'nin yaygınlığı ile özellikle ilgileniyoruz.
