This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.

Reaktifler 1. Hazırlık <ol><li> Agregasyon tamponu hazırlayın (20 mM Tris, pH 7.4, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA). Ay için oda sıcaklığında kararlı saklayın. Kullanımdan önce 1 mM ditiotreitol (DTT), Supplement. Not: HEPES bazlı tampon maddesi (10 mM HEPES, pH 7.5, 0.1 mM EDTA, 5 mM DTT) içinde, aynı zamanda tau toplanmasının içindeki sonuçlar verir. </li><li> T Thioflavin ya da 0.22 um&#39;lik steril bir filtre birimi S stok (agregasyon tamponu içinde çözülmüş 3 mM) solüsyonu ve filtre Thioflavin hazırlayın. Ay, alüminyum folyo ile kararlı kapalı bir tüp içinde -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> (300 uM, toplama tamponu içinde çözülmüş), heparin stok çözelti hazırlayın. -20 ° C&#39;de saklayın, ay boyunca stabildir. </li><li> (Su içinde çözülmüş 1 M,), ditiotreitol (DTT) stok hazırlayın. 1.5 ml tüpler içine kısım. -20 ° C&#39;de saklayın. Agregasyon deneyleri önce oda sıcaklığında 1 M çözelti eritin. Bu 1,000x stoktan deiyonize su ile stok çalışan 100 mM&#39;lik bir kısım hazırlar. Buz üzerinde bırakınhazır olana kadar. </li><li> ° C derin dondurucuda -80 tau çıkarın. Buz üzerinde eritin. Agregasyon tamponu ile önceden belirlenmiş bir konsantrasyona tau ayarlayın. 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 20,800 x g&#39;de bir mikrosantrfuj spin önceden oluşturulmuş büyük topaklar kaldırın. Bu ön-iplik adım protein hazırlık her parti sonraki floresan ölçümü tutarlılık artırır. Başka bir tüp süpernatant aktarın; toplama reaksiyonu monte hazır olana kadar buz üzerinde bırakın. </li></ol> 2. Hayır-boya, Terminal Deneyi NOT: Bu deneyde agregasyon reaksiyonu floresan boya yokluğunda yapılır. Tüm bileşenler karıştırıldıktan sonra reaksiyon, önceden belirlenmiş zaman noktalarında için devam etmesine izin verilir. Saatlik numuneleri daha sonra çekiş reaksiyonu üzerinden alındı ​​ve ThT veya flüoresan okumadan önce bağlayıcı amiloid ths ile karıştırılır. toplama reaksiyonun ilk hacmi gerekli zaman noktalarının sayısına bağlıdır. Bu yaklaşım requ olabilirtau proteininin çok miktarda ire, ancak basit, hızlı ve florometre veya bir çoklu-çukurlu tabla okuyucusu (Tartışma) yapılabilir. Aşağıda adım adım operasyon, bir floresan ölçümü için ISA SPEX FluoroMax-2 kompakt spektrofotometreyi kullanarak. <ol><li> Tablo 1 &#39;deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 100 ml&#39;lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder. Özellikle deney için gereken zaman noktalarında dayalı tüm toplama karışımı için miktarını ayarlayın. Hata pipetlenmesinden yer vermek için her bir bileşenin ek% 10 ekleyin. Burada gösterilen tipik reaksiyon heparin ihtiva eden arakidonik asit ya da agregasyon tamponu ile ikame edilmiş olabilir. Reaksiyon karışımına 1 mM DTT ekleyin. Tüm reaksiyon birden fazla gün sürerse, bir indirgeyici ortam sağlamak için taze DTT gün (1 mM) tamamlar. </li><li> Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Pla37 ° C inkübatör ya da su banyosu içinde, her reaksiyon ce. Ajitasyon tau toplama için gerekli değildir. </li><li> Floresan ölçüm önce, (bilgisayar sonra, ilk lamba) spektroflorometre açın. NOT: hemen kullanılabilecek ksenon ark lambası. Ancak, en iyi sonuçlar makine floresan okumadan önce yaklaşık 10 dakika ısıtın. </li><li> Bilgisayarda yazılımı başlatın. <ol><li> 510 nm (5 nm yarık) için Enstrüman Kontrol Merkezi&#39;nde Gerçek Zamanlı Görüntü modu, (2 nm yarık) 450 nm ayarlanmış dalgaboyu ve emisyon dalga boyu seçin. Kapat Gerçek Zamanlı Görüntü modu penceresi Enstrüman Kontrol Merkezi&#39;ne dönmek için. </li><li> Dalga boyu setleri eklemek için üst çerçevede Sabit Dalgaboyu Analizi, Ekle tuşuna basın &gt;&gt; tuşuna seçin. 1 Standart Hata Set satın alma parametreleri ve 3 Maksimum Denemeler, ardından Ekle&#39;yi tıklatın. ! Git tıklatın Veri Ekran açmak içinpenceresi. </li><li> Veri Görüntüleme penceresinde, Yeni Numune iletişim kutusunu açmak için Başlat ACQ tıklayın. Numune türü için &quot;bilinmeyen&quot; seçiniz. </li></ol></li><li> Her 100 ul çekiş karışımına, 98 ul tampon maddesi birikme ve T. Pipet karıştırmak için birkaç kez, 3 mM Thioflavin 2 ul ekle. </li><li> Bir küvete (FCA3, dış boyut, WxLxH = 12,5 mm x 12.5 mm x 45 mm) tüm karışımı aktarın. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır&#39;ı tıklatın. Verileri kaydetmek. </li><li> Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru. </li></ol> Ile-boya 3. SpectraMax M2 Plaka Reader Sürekli Modu Deneyi NOT: Bu deney, bir floresan boya ThT veya ths agrega dahil olması ile, bir öncekinden farklıdıryon reaksiyonu. Bu reaksiyonlar aynı seti sürekli ölçülmesini sağlar. (SpectraMax M2 çalışması aşağıda gösterildiği gibi) için reaksiyon tekrar kullanılması, bu yöntem, daha iyi bir otomatik, çok oyuklu bir plaka okuyucu ile yapılır. Düzenli florimetre de çalışır ama hızlı toplama reaksiyonların ölçüm sıklığı nedeniyle operasyon manuel doğası, biraz sınırlı. <ol><li> (96-çukurlu, düz siyah levha, iyi ses düzeyini 360 ul, düz taban kısmı), Tablo 2 de olduğu gibi, bir 96-çukurlu plaka içindeki agregasyon karışımı ayarlayın. Her sütun biri için yeterli olan bir 200 ml&#39;lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder zaman noktası ölçümü. Birkaç kez pipetleme iyice karıştırın. Deneyler boyunca her gün taze 1mM DTT Supplement. </li><li> 37 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka inkübe edin. </li><li> Floresan ölçümü öncesinde her bir zaman noktasında, çok modlu mikroplaka okuyucusu ve bilgisayarı açın. Ma için yeterli zaman tanıyınmakina, yaklaşık 10 dakika stabilize etmektir. </li><li> Bilgisayarda yazılımı başlatın. 37 ° C sıcaklık ayarlama ve floresan yoğunluğu (FI-en oku) modunda, 510 nm, 450 nm ve emisyon dalga boyuna ayarlanmış olan uyarım dalga boyunu seçin. </li><li> Çekmece içine 96-plaka takın ve ölçümü başlatmak için OKU tuşuna basın. </li><li> Okuduktan sonra, plaka kaldırmak ve 37 ° C inkübatör geri dönün. Veri analizi ve komplo için bir Excel elektronik veri kopyalayın ve yapıştırın. </li></ol> 4. ile-boya, Sürekli Modu Deneyi bir Kompakt spektroflorometre üzerinde <ol><li> Tablo 3 deki gibi 1.5 ml Eppendorf tüpler içinde, agregasyon karışımı ayarlayın. Her bir sütun, bir zaman noktası ölçümü için yeterli olan bir 200 ml&#39;lik bir reaksiyon için ihtiyaç duyulan bileşenleri temsil eder. </li><li> Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. </li><li> Spektroflorometre açın ve adımları 2.3 ve 2.4 gibi yazılım ayarlayın. </li><li> Bütün karışım, t aktarınoa küvet. Numune-bölmeye örnek tutucuya küvet yerleştirin ve kapağını kapatın. Floresan veri toplamak için Çalıştır&#39;ı tıklatın. Verileri kaydetmek. </li><li> Veri Çalıştır&#39;ı tıklatarak ve kayıt uygun aralıklarla okumaya devam edin. Toplama bir yüksek frekansta (örneğin, her 30 veya 60 sn) olarak izlenecek ise, ya ölüm bitene kadar makinenin küvete ve tepkiyi bırakın, ya da tepkiler veya küvetler takas için yeterli zamanı olduğunda. </li><li> Küvet çıkarın ve çözüm süzün. Distile su 3 kat küvet durulayın. Ve küvet dışarıdaki havayı üfleyerek kuru. </li></ol>

We have nothing to disclose.

Bu protokol, farklı tahlil koşulları ve fosforilasyon-bağımlı hızlı tau toplama kinetik tespit aletleri gösterir. Terminal deneyde, floresans boya ThT her zaman noktasında ana karışımı çıkarılır reaksiyonun bir kısmına ilave edilir. Amiloid floresan sonra 26 ölçülür kaynaklı bağlanma. İkinci olarak, birlikte-boya modunda, tau agregasyonu tau topluluklarının büyüme gerçek-zamanda değerlendirilmesi için uygun bir reaksiyon, bu tür işleme, ThT veya ths mevcudiyetinde gerçekle...

(AD), Alzheimer hastalığı tauopatıler olarak bilinen nörodejeneratif hastalıkların geniş bir koleksiyon biridir. Özetin özeti patoloji yatan tauopathy nöronlar, astrositler ve mikroglia 1-4 nörofibrillerin, NFTler vardır. NFT yoğunluk kognitif bozukluk 3,5 ve nöron kaybı 6 ile ilişkilidir. NFT düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanların (PHF) 7,8 oluşturur (bundan böyle &quot;s-tau&quot; olarak anılacaktır) temel olarak hiperfosforile tau proteinini içerir. Tau nöronal sinyalizasyon ve insan ticareti 9,10 için gerekli olan aksonal taşımacılığının kolaylaştırılması düşünülen bir mikrotübül ilişkili bir proteindir. Her tau molekülü 2 ila 3 normal beyin fosfat, ancak tauopathy hastalarda 11 birkaç kat fosforıl içerik artar içerir. Çoklu kinazlar GSK3 (glikojen sintaz kinaz 3β) ve CDK5 (siklin-de dahil olmak üzere, Tau hiperfosforizasyon&#39;un katkı muhtemeldirasılı kinaz 5) 12,13, ancak patolojik fosforizasyonundan doğrudan tetik zor 14 kalır. Veya mikrotübül bağlanma motifleri yakınındaki anormal fosforilasyon mikrotübül 15 gelen tau ayırır ve p-tau sonunda, NFT inklüzyonlar içine polimerize olabilir, düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanlar halinde oligomerizes somatodendritik bölmesi yerine tau yanlış lokalizasyon neden olur. tau hiperfosforilasyon, NFT oluşumu ve nörodejenerasyonda arasındaki yakın bağ p-tau yumaklar apoptotik ve diğer sitotoksik tepkiler, ve böylece tauopathy nörodejenerasyonda 16,17 altında yatan nedeni olduğunu bir yaygın hipotezine yol açtı. Bu öncül dayalı ilaç ekranları ve erken klinik testler 18 başlatılmıştır. Ancak, bu hipotez zorluklarla 19,20 karşıyadır. Örneğin, SantaCruz ve diğ., Transgenik farelerin bilişsel işlevler bir mutant ekspresyonunu bastırmak suretiyle geliştirilebilir gösterdiNFTler mevcut tau molekülleri 21 oluşturmak için devam olsa insan tau. Bir Drosophila modelinde, NFT temel nöron hücreleri 22,23 korumak için toksik sitosolik tau tecrit gösterilmiştir. Açıktır ki, NFT patogenezi rolü, eğer varsa, çok tauopathy terapötik geliştirme yönünde etkileyecektir. Birkaç β-tabaka tercih edilen floresan boyalar, elektron mikroskobu, ışık saçılması spektroskopisi 24-27 bağlanması ile gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda, yeniden birleştirici ya da normal beyin tau proteini içinde kendiliğinden yavaş yavaş, in vitro olarak, bir PHF-benzeri bir yapı haline polimerize eder. Ekleme heparin ya da arakidonik asit, insan beyninin bir miktarda yağ asidi, büyük ölçüde tau isoform- ve indükleyici, konsantrasyona bağımlı bir davranış 28-32 içinde PHF oluşumunu hızlandırır. Ilginç hiperfosforilize tau AD beyinlerinden saflaştırılmış veya in vitro fosforilasyon reaksiyonlarında ayrıntılı tarafından hazırlananDaha hızlı ve daha verimli bir ggregates 26,33-35. Bu sonuçlar p-tau patolojik rolleri ile mükemmel bir uyum içindedir. F-tau agregasyonu dayanan bir in vitro sistem, böylece, AD ilaç taraması için güçlü bir araç olarak hizmet edebilmektedir. Tau toplanması ve AD ilerici nörodejenerasyona arasındaki yakın ilişki, yanı sıra Aβ plak hedefleme ilaç geliştirme son yetmezliği, MS 36-38 başka önemli histolojik işaretleyici, tau toplama artıyor kontrol ilaçları keşfetmek ilgi göz önüne alındığında. Nitekim, çeşitli gruplar zaten birincil tahlil gibi in vitro tau toplama reaksiyonlarda kullanarak, farklı verim ilaç ekranları başladı. Bir kimyasal madde sayısı in vitro 39-42 tau agregasyonu üzerinde inhibe edici ya da tersine aktivite sergilediği bulundu. Ancak, mevcut tüm tau toplama regülatörü ekranlar fosfor anahtar patolojik işareti özlüyor değiştirilmemiş tau kullanınylation, AD tedavisinde bu bileşiklerin kullanıldığı özgüllük ve etkinliği için bir endişe yükselterek. Biyokimyasal karakterizasyonu AD ilaç taraması için çekiş tahlilleri geliştirilmesi önemli engellerden biri patofizyolojik ilgili hiperfosforile tau proteininin yeterli miktarlarda üretilmesidir. Tau 1N4R izoformu ve GSK-3β kinaz E. koeksprime edildiği Fermuarlar Destekli Kataliz sistemi kullanarak E. coli lösin zipper füzyon proteinleri olarak, bu sorunun üstesinden gelebilmek olan (. Sui ve arkadaşları, R.L. tau ve p-tau son ürünler için bakınız Şekil 1, aynı zamanda, p-tau ön kütle spektrometresi karakterizasyonu için 43 bakınız). Tau&#39;nun farklı fosforilasyon bölgeleri için özel dokuz bir antikorlar panelinin kaynaktan, pozitif sinyaller sekiz pozisyonda görülmüştür (veriler gösterilmemiştir). Aşağıda, biz toplama kinetik d ayırt edebilir protokolleri ve instrumentations tarifdeğiştirilmemiş tau ve p-tau türleri arasındaki ifferences. Bu testler amiloid (tau agrega) üzerine Tioflavin T (ThT) veya tioflavin S (THS) olarak floresan artışı 26 bağlayıcı ölçülen yayınlanan protokolleri modifiye edildi. İlk &quot;terminali&quot;, hiçbir boya yaklaşımı, toplama reaksiyonları monte edilir ve amiloid boya yokluğunda kuluçkaya. Farklı zaman noktalarında, her bir reaksiyonun bir tümböleni çıkarıldı ve tau toplulukları bağlamak için THT toplanmasını durdurmak ve izin vermek için ThT-içeren tampon eşit hacmi ile karıştırılmıştır. Floresans, bir IAP FluoroMax-2 florometre ile ölçülür. &quot;Ile-boya&quot; İkinci sürekli izleme deneyi, ThT veya THS toplama reaksiyonlarda yer almaktadır. Floresan elle tüm deney boyunca sürekli olarak ölçülür veya çok plaka okuyucu kullanarak olabilir. Buna ek olarak, sürekli ölçüm mo toplama için tau ve p-tau yakın bir fizyolojik konsantrasyon kullanan bir analiz tanımlamaktadırlarde. fosforilasyon etki hali hazırda farkedilebilir şekilde kalır. Aşağıda, biz adım adım operasyon prosedürlerini tanımlamak ve bu tahlillerin temsilcisi sonuçları gösterecektir. Her yaklaşımın artılarını ve eksilerini bazı Tartışma, yanı sıra potansiyel ilaç tarama uygulamaları takip edecek. Yüksek konsantrasyonda tau kendiliğinden amiloid benzeri yapılar halinde toplanır. Bununla birlikte, laboratuvarda tau fibrillization tipik haliyle bu tür teşvik ediciler olarak heparin (ortalama molekül ağırlığı 6000 g / mol) ve arakidonik asit ile hızlandırılır. Burada gösterilen örnek 30 uM heparin içerir. Tau amiloid birikintilerinin oluşmasının Tioflavin T (ThT) ile ya da S (ths) Thioflavin bağlayıcı amiloid elde edilen fluoresans ile izlenir. (:;: 485 nm tepe emisyon 450 nm eksitasyon) tau topluluklarının bağlanma üzerine, ThT floresans kırmızı kayma gösterir. Ths, diğer taraftan, amiloid bağlayıcı önce 510 nm&#39;de (450 nm&#39;de uyanm) zayıf emisyon vardır, ancak bu fluorescencBu tür birleştirilmiş tau 44 gibi önemli bir amiloid proteininin mevcudiyetinde E artar. Her iki boya da tau ve p-tau bağlantısını tespit iyi çalışır. Çünkü ThT (bakınız Şekil 2), güçlü ve nispeten geniş emisyon tepe, 510 nm&#39;de flüoresan biriminde sadece% 30 bir azalma vardır. Ya boya kullanırken kolaylık sağlamak için, biz tau izlemek için uyarma / emisyon dalga boylarında (yani, 450 nm / 510 nm) aynı kombinasyonunu kullanabilirsiniz. Tau agregasyonu deneyinin amacına ve tau proteininin mevcudiyetine bağlı olarak, boya varlığında veya yokluğunda yapılabilir. Reaksiyonların her ikisi de modları aşağıda gösterilmiştir. Tek-örneklem flüorometre (ISA-Spex FluoroMax-2) ve bir çok plaka okuyucu (SpectraMax M2) - Ayrıca, iki farklı araçların çalışmasını göstermektedir. Okuyucular kendi özel ihtiyaçlarını ve enstrüman kullanılabilirliğini uygun bu protokolleri adapte gerekir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="449">
	<tbody>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">Name of the reagent</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:103px;">Catalogue number</td>
			<td style="width:103px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Trizma&#160;base</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1503</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">NaCl</td>
			<td style="width:128px;">Macron Fine Chemicals</td>
			<td style="width:103px;">MAL-7581-06</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:128px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">15576-028</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin T</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T3516</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">Thioflavin S</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">T1892</td>
			<td style="width:103px;">Stored in dark</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:116px;">heparin</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">H3393</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:116px;">DL-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">D9779</td>
			<td style="width:103px;">Stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:116px;">96-well plate</td>
			<td style="width:128px;">Corning</td>
			<td style="width:103px;">3917</td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:116px;">ISA SPEX FluoroMax-2</td>
			<td style="width:128px;">Horiba</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="148">
			<td height="148" style="height:148px;width:116px;">SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader</td>
			<td style="width:128px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td style="width:103px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:116px;">Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody</td>
			<td style="width:128px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:103px;">MAB3494</td>
			<td style="width:103px;">Stored at &#8211;80&#176;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro aggregation assays using hyperphosphorylated tau protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Rekombinant tau ve p-tau (Şekil 1) kullanılarak, protein agregatları amiloid bağlama sahasına bağlanması üzerine ThT ve TH&#39;nin güçlü bir floresan emisyonu, aşağıdakileri içeren tau yararlanarak, tau ve p-tau agregasyonu kinetiklerini karşılaştırmak için iki farklı protokol kurulmuş ve p-tau (Şekil 2). Ile ya da toplama reaksiyonda floresan boya olmadan, biz hiperfosforilasyon (Şekil 3-5) tarafından tau toplanmasının tutarlı geliştirme g?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein at JoVE.com

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü.

In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

in-vitro-aggregation-assays-using-hyperphosphorylated-tau-protein

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

18.2K Görüntüleme.  Michigan State University.  Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü. 

Video: In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Organik Solvent ve Asetik Asit olmadan Jeller Coomassie G-250 ile Proteinlerin Boyama

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Biyoloji

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Sıvı Faz Kurtarma Moleküler Ağırlık Tabanlı Fraksiyonu GELFREE 8100 Fraksiyonu Sisteminin Kullanılması

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

Biyolojik Tahliller Manyetik Modülasyon Biyoalgılayıcı Sistemi kullanarak hızlı Homojen Algılama

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

Schwann-astrosit Etkileşimleri Analizi In Vitro Tahliller

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

Canlı Hücrelerde Protein Aggregation 4D Görüntüleme

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In vitro Metilasyona Tahlil Protein Arginin metilasyon Okuyacak

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Membran proteinlerinin Yeşil floresan proteini temelli Ekspresyon elemesinde<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...