OP9-Delta-1 ko-kültür sistemini kullanarak insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı tümör antijene özgü CD8 alfa beta tek pozitif T hücreleri üretmek için bir yöntem salıyoruz. Bu yöntem in vitro T hücre üretimi için güçlü bir araçtır ve rejeneratif tıp ve hücre bazlı tedavilerde kullanılmak üzere in vitro türetilmiş T hücrelerinin gelişimini kolaylaştıracaktır. Ayrıca diğer lenfositlerin üretimi için adapte edilebilir, NK hücreleri gibi.
Bu tekniği yaparken, hücre-hücre sitoplazmik temas hücre farklılaşması nı ve yaşlanmayı önlemeye başladığında FBS ve passage OP9-Delta-1 hücrelerinin çoğunu tutarlı bir şekilde önceden değerlendirmek önemlidir. Prosedürü gösteren Dr. Meghan Good, ekibimden cerrahi onkoloji uzmanı. Bir stereo-mikroskop insan iPSC kolonileri kontrol ederek başlayın ve 200 mikrolitrelik pipet ucu plastik kenarı ile kültürden farklılaşma herhangi bir alanda kaldırın.
Koloniler çapı 0.8 ila 1.2 milimetreye ulaştığında, insan iPSC'lerini iletir. Harcanan medya aspire ve 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen insan iPSC medya 10 mililitre ekleyin. Tek kullanımlık bir hücre geçiş aletini tek bir yönde tüm çanak boyunca türün üzerinde türün, tek tip basıncı koruduğundan ve tüm silindir bıçağın kültür kabına dokunduğundan emin olun.
Kültür çanağını 90 derece döndürün ve yuvarlanma tekrarlayın. Kolonilerin mikroskopla düzgün kesilmesini görsel olarak doğrulayın. Damalı gibi görünmeliler.
Daha sonra, 200 mikrolitrelik pipet ile nazik mekanik yıkama ile kesilmiş koloniler ayırmak. Görsel koloni kümelerinin sayısını tahmin ve rock inhibitörü ile desteklenen taze insan iPSC medya 10 mililitre ile fare embriyonik fibroblastlar yeni bir 10 santimetrelik çanak 350 ve 600 kümeleri arasında transfer. Yemeği bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, harcanan medya aspirate ve taze insan iPSC medya 10 mililitre ekleyin. Hücre büyüme hızına bağlı olarak, her bir veya iki günde bir ortamı değiştirin. Kültür OP9-Delta-1 hücreleri OP9 medyada 37 santigrat derece.
Onlar biraraya ulaştığında, medya aspire, ve 1x magnezyum beş mililitre ile hücreleri yıkamak, kalsiyum, ve fenol kırmızı içermeyen PBS. PBS aspire, 05% tripsin-EDTA iki mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece beş dakika boyunca hücreleri kuluçka. Daha sonra, OP9 medya dört mililitre ekleyin ve mekanik pipetleme hücre tabakası ayrıştırMak.
Hücre süspansiyonuna 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 4 santigrat derecede 300 kez santrifüj verin. Supernatant aspire ve OP9 medya 12 mililitre hücreleri resuspend. Altı yeni hücre kültürü yemeğinin her birine sekiz mililitre OP9 ortam ekleyin ve her yemeğin üzerine iki mililitre OP9-delta-1 hücre süspansiyonu plakası koyun.
Hücrelerin eşit dağılımını sağlamak için çanak tarafı yan yana ve önden arkaya sallayın. Hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın ve hücreler birleştiğinde geçişi tekrarlayın. İnsan iPSC'leri ile ortak kültürden bir hafta önce jelatinize OP9-Delta-1 yemekleri hazırlayın.
Üç yeni hücre kültürü yemekleri için% 0.1 jelatin dört mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece onları 30 dakika kuluçka. Kuluçkadan sonra jelatini aspire edin ve her çanağa sekiz mililitre OP9 media ekleyin. Op9-Delta-1 hücrelerinden oluşan bir parçayı üç jelatin kaplı tabağa aktarın.
Dört gün sonra, her bir hücre yemeğine, her yemek başına toplam 20 mililitre ortam için 10 mililitre OP9 ortam ekleyin. Op9-Delta-1 eşzamanlı yemekler yedi ila sekiz gün hücreleri geçtikten sonra insan iPSC co-kültür başlayın. İnsan iPSCs bir confluent çanak medya aspire ve OP9 medya 10 mililitre ekleyin.
Tek kullanımlık bir hücre geçiş aracı kullanarak hücre kolonilerini kesip ayırın ve 10 mililitre taze OP9 ortamiçeren önceden jelatinize edilmiş OP9-Delta-1 yemeğine 350 ila 600 kümekesilmiş koloni aktarın. Kolonilerin eşit dağılımını sağlamak için kültür çanak yan yana ve önden arkaya rock. Ertesi gün, harcanan medya aspirate ve taze OP9 medya 20 mililitre ile değiştirin.
Op9-Delta-1'de bir gün boyunca birlikte kültürlenmiş insan iPSC kümeleri küçük, yuvarlak, tek katmanlı koloniler olarak görünmelidir. Beşinci günde, 10 mililitre harcanan medyayı aspire edin ve 10 mililitre taze OP9 medya ekleyin. Koloniler çok katmanlı karanlık bir merkez ile karakterize ilkel mezoderm, farklılaşmaya başlayacaktır.
Dokuzuncu günde bu işlemi tekrarlayın, bu noktada çok katmanlı merkez yapıları kubbe benzeri şekillere dönüşecektir. 13. günde hematopoetik ata hücrelerini hasat edin, bu noktada yapılar kubbe benzeri alanlardan oluşan bir ağ la çevrili karanlık bir merkezi organoidden oluşur. Aspire medya, ve kalsiyum ve magnezyum ile 1x fenol kırmızı-free Hanks'balanced tuz çözeltisi beş mililitre ile hücreleri bir kez yıkayın, veya HBSS.
Yıkamadan sonra, HBSS 10 mililitre için 5, 000 birim-başına mililitre kollajenaz IV 250 mikrolitre ekleyin. Karışım hücreleri ekleyin ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derece onları kuluçka. HBSS-kollajenaz karışımıaspire ve pbs beş mililitre ile hücreleri bir kez yıkayın.
PBS ile yıkadıktan sonra, %0,25 tripsin-EDTA'dan beş mililitre ekleyin ve hücreleri 37 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, OP9 medya dört mililitre ekleyin ve tek hücreli süspansiyon yapmak için pipetleme hücre tabakası ayrıştırın. Hücre süspansiyonuna 100 mikrometrelik bir süzgeçten 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve tüpü 300 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj edin.
Supernatant aspire ve OP9 medya 10 mililitre hücreleri resuspend. Yeni bir jelatinize 10 santimetre hücre kültür çanak üzerinde hücre süspansiyon plaka ve 45 dakika boyunca 37 santigrat derece onları kuluçka. Daha sonra, nazik pipetleme ile yapışık olmayan hücreleri toplayın.
Hücre süspansiyonuna bir süzgeç aracılığıyla 50 mililitrelik konik tüpe ve daha önce açıklandığı gibi santrifüje aktarın. Daha sonra, supernatant aspire ve farklılaşma medya 10 mililitre hücreleri resuspend. Yeni bir OP9-Delta-1 confluent çanak üzerine hücre süspansiyon plaka.
16. günde hücreleri el yazması talimatlara göre geçirin ve yapışık olmayan hücreleri beş ila yedi günde bir geçirmeye devam edin. 35 günlük farklılaşmadan sonra, CD4-pozitif hücre popülasyonunu üreticinin protokolüne göre CD4 manyetik boncuk izolasyonu ile zenginleştirin. Daha sonra, OP9 medya hücreleri resuspend, ve bir doku kültürü her kuyuiçine hücre süspansiyon plaka, düz alt, confluent OP9-Delta-1 24-iyi plaka.
İnsan IL-2 100 uluslararası birimleri, insan IL-7 beş nanogram, anti-insan CD3 antikor 500 nanogram ve anti-insan CD28 antikor iki mikrogram ekleyerek hücreleri uyarmak her kuyu. Dört ila yedi gün sonra, hücreler daha fazla analiz için toplanabilir. İnsan kök hücre faktörü varlığında jelatinize olmayan OP9-Delta-1 kültür sonra, insan FLT3-ligand, ve insan interlökin-7, hematopoetik ataları CD3, CD7, CD4 ve CD8 çift pozitif T soy hücreleri, çoğunluğu MART1tope özgü T hücre reseptörlerini ifade ayırt.
CD4, CD8 çift pozitif T hücreleri insan interlökin-7 ve 2 varlığında anti-insan CD3 ve CD28 antikorları ile uyarıldığında, CD3-pozitif CD8 alfa beta tek pozitif hücrelerin sayısı arttı ve MART1 epitop için spesifik kaldı, kalıtsal antijen özgüllüğünün korunmasını doğrulayan. BIR ELISpot testi, MART1 peptid varlığında kültürlü zaman, insan iPSC kaynaklı CD8 alfa beta tek pozitif T hücreleri hem toplu ve CD8 alfa alfa tek pozitif T hücreleri ile karşılaştırıldığında interferon gama yüksek miktarlarda salgılar. T hücreleri ve antijen sunan hücreler için tek başına interferon gama ekspresyonu saptanmadı, bu da insan T-iPSC kaynaklı T hücrelerinin antijene özgü ve fonksiyonel olduğunu gösterdi.
Bu yöntemde önemli bir adım CD4-negatif, CD8-negatif çift negatif hücreleri ortadan kaldırmak için CD4 manyetik boncuk zenginleştirme, hangi stimülasyon üzerine çift pozitif hücrelerin doğrudan öldürülmesine neden olabilir. Bu teknik hematopoetik kök hücreler ve embriyonik kök hücreler de dahil olmak üzere insan hücrelerinin çeşitli kaynakları ile kullanılmak üzere geçerlidir. Bu yöntemle oluşturulan iPSC kaynaklı olgunlaşmamış T hücreleri, gelecekteki terapötik kullanım için olgun insan tümörü antijene özgü najene özgü naif benzeri T hücrelerinin üretimi için daha da geliştirilebilir.
Bu videoyu izledikten sonra, izleyici OP9-Delta-1 co-kültür sistemini kullanarak insan iPSC kaynaklı CD8 alfa beta tek pozitif T hücreleri oluşturmak için nasıl anlamak gerekir.
