OP9-Delta-1共培養系を用い、ヒト誘導多能性幹細胞由来腫瘍抗原特異的CD8αββ単陽性T細胞を生成する方法を提示する。この方法は、インビトロT細胞生成のための強力なツールであり、再生医療および細胞ベースの治療法で使用するためのインビトロ由来T細胞の開発を促進します。また、NK細胞のような他のリンパ球の生成に適応することもできる。
この技術を行う場合、細胞間細胞間接触が細胞分化および老化を防止し始めると、FBSおよび継通路OP9-Delta-1細胞のロットを一貫して事前評価することが重要である。この手順を実証することは、私のチームの外科腫瘍学フェローであるDr.Meghan Goodです。ステレオ顕微鏡でヒトiPSCコロニーをチェックすることから始め、200マイクロリットルのピペットチップのプラスチックエッジを使用して培養から分化する領域を取り除きます。
コロニーが直径0.8~1.2ミリメートルに達すると、ヒトiPSCを通過する。使用済み培地を吸引し、10マイクロモルロック阻害剤を添加したヒトiPSC培地を10ミリリットル添加する。使い捨てセルの通過ツールを皿全体に一方向に転がし、均一な圧力を維持し、ローラーブレード全体が培養皿に触れます。
培養皿を90度回転させ、転がりを繰り返します。顕微鏡でコロニーの適切な切断を視覚的に確認する。これらは、チェッカー表示されます。
次に、200マイクロリットルのピペットで穏やかな機械的な洗浄によって切断されたコロニーを取り外します。コロニー塊の数を視覚的に推定し、350〜600の塊をROCK阻害剤を添加した新鮮なヒトiPSC培地の10ミリリットルを備えたマウス胚性線維芽細胞の新しい10センチメートル皿に移す。一晩37度でインキュベートします。
翌日、使用済みメディアを吸引し、新鮮なヒトiPSCメディアを10ミリリットル加える。細胞の増殖速度に応じて、1日または2日ごとにメディアを交換します。OP9-Delta-1細胞を37°CでOP9培地で培養する。
彼らは合流に達したら、培地を吸引し、1xマグネシウム、カルシウム、フェノール赤自由PBSの5ミリリットルで細胞を1回洗浄します。PBSを吸引し、05%トリプシン-EDTAの2ミリリットルを加え、摂氏37度で5分間培養します。次いで、OP9培地を4ミリリットル添加し、ピペット処理により細胞層を機械的に解化する。
セル懸濁液を100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離機を摂氏4度で300倍にして5分間移動する。上清を吸引し、OP9培地の12ミリリットルで細胞を再懸濁する。6つの新しい細胞培養皿のそれぞれに8ミリリットルのOP9培地を加え、OP9-delta-1細胞懸濁液の2ミリリットルを各皿に盛り付けます。
細胞の均等な分布を確保するために、皿を左右に揺らし、前後に揺れます。37°Cで細胞をインキュベートし、細胞が合流に達したときに通過を繰り返します。ヒトiPSCとの共培養の1週間前に、ゼラチン化OP9-Delta-1料理を準備します。
3つの新しい細胞培養皿に0.1%ゼラチンの4ミリリットルを加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ゼラチンを吸引し、各皿に8ミリリットルのOP9培地を加える。OP9-Delta-1細胞のコンフルエントディッシュを3つのゼラチンコーティングされた料理にパッセージする。
4日後、細胞の各皿に10ミリリットルのOP9培地を加えて、1皿あたり合計20ミリリットルのメディアを追加します。OP9-Delta-1コンフルエントディッシュでヒトiPSCの共同培養を開始し、細胞を通過してから7~8日後に培養します。ヒトiPSCのコンフルエント皿からメディアを吸引し、OP9培地を10ミリリットル加える。
使い捨てセル通過ツールを使用して細胞コロニーを切断および取り外し、10ミリリットルの新鮮なOP9培地を含む前にゼラチン化されたOP9-Delta-1皿に350〜600個の切断コロニーを移します。コロニーの均等な分布を確保するために、左右に、そして前後に培養皿を揺らす。翌日、使用済みメディアを吸引し、20ミリリットルの新鮮なOP9メディアに置き換えます。
OP9-Delta-1で1日共同培養したヒトiPSC塊は、小さく丸い単層コロニーとして現れるべきである。5日目には、10ミリリットルの使用済みメディアを吸引し、10ミリリットルの新鮮なOP9培地を追加します。コロニーは、多層暗い中心によって特徴付けられる原始的な中皮に分化し始める。
このプロセスを 9 日目に繰り返し、その時点でマルチレイヤーの中心構造がドームのような形に進化します。13日目に造血前駆細胞を収穫し、その時点で構造はドーム状領域のネットワークに囲まれた暗い中央オルガノイドで構成される。培地を吸引し、カルシウムとマグネシウム、またはHBSSで1xフェノール赤フリーハンクスバランス塩溶液の5ミリリットルで細胞を1回洗浄します。
洗浄後、HBSSを10ミリリットルに5,000単位/ミリリットルコラゲターゼIVの250マイクロリットルを加えます。混合物を細胞に加え、摂氏37度で45分間インキュベートします。HBSS-コラゲターゼ混合物を吸引し、5ミリリットルのPBSで細胞を1回洗浄する。
PBSで洗浄した後、0.25%トリプシン-EDTAの5ミリリットルを加え、20分間摂氏37度で細胞をインキュベートします。次いで、OP9培地を4ミリリットル添加し、ピペット処理により細胞層を解約して単一細胞懸濁液を作った。セルサスペンションを100マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐管に移し、チューブを300倍gと摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を吸引し、OP9培地の10ミリリットルで細胞を再懸濁する。新しいゼラチン化された10センチメートルの細胞培養皿に細胞懸濁液を盛り付け、摂氏37度で45分間インキュベートする。次に、穏やかなピペットによって任意の非接着細胞を収集します。
ストレーナーを介して50ミリリットル円錐形チューブに細胞懸濁液を移し、前述のように遠心分離機を使用します。次いで、上清を吸引し、10ミリリットルの分化培地中で細胞を再懸濁する。新しいOP9-Delta-1コンフルエント皿に細胞懸濁液をプレートします。
原稿の方向に従って16日目に細胞を通過させ、その後5〜7日ごとに非接着細胞を通過し続ける。35日間分化した後、メーカーのプロトコルに従ってCD4磁気ビーズ分離によりCD4陽性細胞集団を濃縮します。次いで、OP9培地中の細胞を再懸濁し、1ミリリットルの細胞懸濁液を組織培養の各ウェルにプレートし、コンフルエントOP9-Delta-1の平底、24ウェルプレートをプレートする。
ヒトIL-2の100の国際的な単位、ヒトIL-7の5ナノグラム、抗ヒトCD3抗体の500ナノグラム、および各ウェルに抗ヒトCD28抗体の2マイクログラムを加えることによって細胞を刺激する。4~7日後、細胞を採取してさらなる分析を行うことができます。ヒト幹細胞因子、ヒトFLT3-リガンド、およびヒトインターロイキン-7の存在下で非ゼラチン化OP9-Delta-1に培養した後、造血前駆体をCD3、CD7、CD4、およびCD8二重陽性T系統細胞に分化し、その大部分はMART1エピトープに特異的なT細胞受容体を発現した。
CD4、CD8二重陽性T細胞をヒトインターロイキン-7および2の存在下で抗ヒトCD3およびCD28抗体で刺激した場合、CD3陽性CD8αβ単陽性細胞の数はMART1エピトープに特異的であり、それらの遺伝抗原特異性の保存を確認した。ELISpotアッセイは、MART1ペプチドの存在下で培養すると、ヒトiPSC由来CD8αβ単陽性T細胞がバルクおよびCD8アルファアルファ単陽性T細胞の両方と比較してより高い量のインターフェロンガンマを分泌することを明らかにした。T細胞と抗原提示細胞だけではインターフェロンガンマ発現は検出されず、ヒトT-iPSC由来のT細胞が抗原特異的かつ機能的であることを実証した。
この方法の重要なステップは、CD4陰性、CD8陰性の二重陰性細胞を排除するCD4磁気ビーズ濃縮であり、刺激時に二重陽性細胞を直接殺す可能性がある。この技術は、造血幹細胞および胚性幹細胞を含むヒト細胞のいくつかの供給源での使用に適用可能である。この方法により生成されたiPSC由来の未熟T細胞は、将来の治療用に成熟ヒト腫瘍抗原特異的ナイーブ様T細胞の生成のためにさらに改善され得る。
このビデオを見た後、視聴者はOP9-Delta-1共培養システムを用いてヒトiPSC由来CD8 αβ単一陽性T細胞を生成する方法を理解する必要があります。
