نقدم طريقة لتوليد البشرية المستحثة متعددة القدرات المستمدة من الخلايا الجذعية المضادة للورم محددة CD8 ألفا بيتا خلايا T إيجابية واحدة باستخدام OP9-دلتا-1 نظام الثقافة المشتركة. هذه الطريقة هي أداة قوية لتوليد الخلايا في المختبر T وسوف تسهل تطوير الخلايا التائية المشتقة من المختبر لاستخدامها في الطب التجديدي والعلاجات القائمة على الخلايا. ويمكن أيضا أن تتكيف مع توليد الخلايا الليمفاوية الأخرى، مثل الخلايا NK.
عند تنفيذ هذه التقنية، من المهم أن تقييم ما قبل الكثير من FBS و ومرور الخلايا OP9-دلتا-1 باستمرار عندما خلية إلى خلية الاتصال السيتوبلازم تبدأ لمنع تمايز الخلية و senescence. إثبات العملية ستكون الدكتورة ميغان جود، زميلة أورام جراحية من فريقي. ابدأ بفحص مستعمرات iPSC البشرية في مجهر ستيريو ، وإزالة أي مناطق من التمايز من الثقافة مع الحافة البلاستيكية من طرف ماصة 200 ميكرولتر.
عندما تصل المستعمرات 0.8 إلى 1.2 ملليمتر في القطر، مرور iPSCs الإنسان. التعرق وسائل الإعلام المستهلكة، وإضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام iPSC الإنسان تكمل مع مثبط الصخور الدقيقة 10. لفة أداة تمرير الخلايا القابل للتصرف عبر الطبق بأكمله في اتجاه واحد، مع التأكد من الحفاظ على ضغط موحد وأن النصل الأسطوانة بأكملها يلامس طبق الثقافة.
تدوير طبق الثقافة 90 درجة، وتكرار المتداول. بصريا تأكيد القطع السليم للمستعمرات مع المجهر. يجب أن تظهر متقلبة.
ثم، فصل المستعمرات قطع عن طريق التنظيف الميكانيكية لطيف مع ماصة 200 ميكرولتر. تقدير بصريا عدد كتل مستعمرة، ونقل ما بين 350 و 600 كتل إلى طبق جديد 10 سنتيمترا من الخلايا الليفية الجنينية الماوس مع 10 ملليلتر من وسائل الإعلام iPSC الإنسان الطازجة تستكمل مع مثبط روك. احتضان الطبق بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
في اليوم التالي ، تتبخر الوسائط المستهلكة ، وتضيف 10 ملليلتر من وسائل الإعلام iPSC البشرية الطازجة. تغيير وسائل الإعلام كل يوم أو يومين، اعتمادا على معدل نمو الخلايا. ثقافة الخلايا OP9-دلتا-1 في وسائل الإعلام OP9 في 37 درجة مئوية.
عندما تصل إلى التقاء، الاستنشاق وسائل الإعلام، وغسل الخلايا مرة واحدة مع خمسة ملليلتر من المغنيسيوم 1x، والكالسيوم، والفينول الأحمر خالية من برنامج تلفزيوني. استلهم برنامج تلفزيوني، أضف ملليلترين من 05٪ تبسين-EDTA، واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية. ثم، إضافة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام OP9، وميكانيكيا فصل طبقة الخلية عن طريق الأنابيب.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر من خلال مصفاة خلية 100 ميكرومتر، وطاردة مركزية في 300 مرة ز في أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تعرق المابير، وإعادة تعليق الخلايا في 12 ملليلتر من وسائل الإعلام OP9. إضافة ثمانية ملليلتر من وسائل الإعلام OP9 إلى كل من ستة أطباق ثقافة الخلية الجديدة، ولوحة ملليلتر من تعليق الخلايا OP9-دلتا-1 على كل طبق.
صخرة طبق الجانب إلى الجانب ومن الأمام إلى الخلف لضمان توزيع الخلايا حتى. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية، وتكرار مرور عندما تصل الخلايا إلى التقاء. إعداد الأطباق OP9-Delta-1 الجيلاتية قبل أسبوع من المشاركة في الثقافة مع iPSCs الإنسان.
إضافة أربعة ملليلتر من 0.1٪ الجيلاتين إلى ثلاثة أطباق جديدة ثقافة الخلية، واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، وpirate استنشاق الجيلاتين، وإضافة ثمانية ملليلتر من وسائل الإعلام OP9 إلى كل طبق. مرور طبق واحد من الخلايا OP9-دلتا-1 إلى ثلاثة أطباق مغلفة بالجيلاتين.
بعد أربعة أيام، إضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام OP9 إلى كل طبق من الخلايا، ما مجموعه 20 ملليلتر من وسائل الإعلام في الطبق الواحد. ابدأ بثقافة iPSC البشرية المشتركة على أطباق OP9-Delta-1 الناشبة بعد مرور الخلايا من سبعة إلى ثمانية أيام. التعرق وسائل الإعلام من طبق التقاء من iPSCs الإنسان، وإضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام OP9.
قص وفصل مستعمرات الخلايا باستخدام أداة تمرير الخلايا القابلة للتصرف ، ونقل 350 إلى 600 كتل من المستعمرات المقننة على طبق OP9-Delta-1 قبل الجيلاتين مع 10 ملليلترات من وسائط OP9 جديدة. صخرة طبق الثقافة جنبا إلى جنب ومن الأمام إلى الخلف لضمان توزيع حتى المستعمرات. في اليوم التالي ، تتبخر وسائل الإعلام المستهلكة ، واستبدالها بـ 20 ملليلترًا من وسائل الإعلام OP9 الجديدة.
يجب أن تظهر كتل iPSC البشرية المشتركة في الثقافة على OP9-دلتا-1 ليوم واحد كمستعمرات صغيرة، مستديرة، أحادية الطبقة. في اليوم الخامس ، pirate 10 ملليلتر من وسائل الإعلام المستهلكة ، وإضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام OP9 جديدة. سوف تبدأ المستعمرات في التفريق إلى الميزدرة البدائية، والتي تتميز بمركز مظلم متعدد الطبقات.
كرر هذه العملية في اليوم التاسع، وعند هذه النقطة ستتطور هياكل مركز متعدد الطبقات إلى أشكال تشبه القبة. حصاد خلايا السلف المكونة للدم في اليوم 13 ، وعند هذه النقطة تتكون الهياكل من الجهاز العضوي المركزي الداكن محاطة بشبكة من المناطق الشبيهة بقبة. استلهمي وسائل الإعلام، وغسل الخلايا مرة واحدة مع خمسة ملليلترات من 1x الفينول الأحمر خالية Hanks'balanced حل الملح مع الكالسيوم والمغنيسيوم، أو HBSS.
بعد الغسيل، أضف 250 ميكرولترات من 5، 000 وحدة لكل ملليلتر كولاجيناز الرابع إلى 10 ملليلتر من HBSS. يُضاف الخليط إلى الخلايا، ويُحضنها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. التعرق خليط كولاجيناز HBSS، وغسل الخلايا مرة واحدة مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني.
بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني، إضافة خمسة ملليلتر من 0.25٪ تريبسين-EDTA، واحتضان الخلايا في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم، إضافة أربعة ملليلتر من وسائل الإعلام OP9، وفصل طبقة الخلية عن طريق الأنابيب لجعل تعليق خلية واحدة. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر من خلال مصفاة 100 ميكرومتر، والطرد المركزي الأنبوب في 300 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
استلهمت المابير، و resuspend الخلايا في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام OP9. لوحة تعليق الخلية على طبق ثقافة خلية جديد طوله 10 سنتيمترات، واحتضانها عند درجة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. ثم، وجمع أي خلايا غير المنضمين عن طريق الأنابيب لطيف.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر من خلال مصفاة، والطرد المركزي كما هو موضح سابقا. ثم، الطامح من يبطن، و resuspend الخلايا في 10 ملليلتر من وسائل الإعلام التمايز. لوحة تعليق الخلية على طبق OP9-دلتا-1 التقاء جديدة.
تمر الخلايا في اليوم 16 وفقا لاتجاهات المخطوطة، وتستمر في تمرير الخلايا غير المنضمة كل خمسة إلى سبعة أيام بعد ذلك. بعد 35 يوما من التمايز، إثراء الخلايا CD4 إيجابية من قبل CD4 عزل حبة المغناطيسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. ثم، resuspend الخلايا في وسائل الإعلام OP9، ولوحة ملليلتر واحد من تعليق الخلية في كل بئر من الأنسجة والثقافة، شقة القاع، 24 جيدا لوحة من OP9-دلتا-1 التقاء.
تحفيز الخلايا عن طريق إضافة 100 وحدة دولية من IL-2 الإنسان، وخمس نانوغرام من IL-7 الإنسان، 500 نانوغرام من الأجسام المضادة ليتان CD3 المضادة للإنسان، واثنين من ميكروغرام من الأجسام المضادة لمضادات CD28 المضادة للإنسان إلى كل بئر. بعد أربعة إلى سبعة أيام، يمكن جمع الخلايا لمزيد من التحليل. بعد الثقافة على غير الجيلاتي OP9-دلتا-1 في وجود عامل الخلايا الجذعية البشرية, الإنسان FLT3-ligand, والإنسان interleukin-7, progenitors الدم متمايزة في CD3, CD7, CD4, وD8 خلايا نسب T مزدوجة الإيجابية, وأعرب معظمها مستقبلات الخلايا التائية محددة إلى ظهارة MART1.
عندما CD4, CD8 كانت حفزت الخلايا التائية مزدوجة الإيجابية مع المضادة للانسان CD3 وD28 الأجسام المضادة في وجود الإنسان interleukin-7 و 2, عدد CD3-positive CD8 بيتا بيتا خلايا واحدة الإيجابية زيادة وظلت محددة لeptope MART1, مؤكدا الحفاظ على خصوصية المستضد موروثة. وكشفت مقايسة ELISpot أنه عندما مثقف في وجود الببتيد MART1, الإنسان iPSC المستمدة CD8 ألفا بيتا خلايا T إيجابية واحدة تفرز كميات أعلى من غاما إنترفيرون مقارنة مع كل من الجزء الأكبر و CD8 ألفا ألفا خلايا T إيجابية واحدة. لم يتم الكشف عن أي تعبير غاما إنترفيرون للخلايا التائية والخلايا المستضدية التي تقدم وحدها، مما يدل على أن الخلايا التائية المشتقة من T-iPSC هي خلايا مستضدية محددة وظيفية.
خطوة هامة في هذه الطريقة هي CD4 التخصيب حبة المغناطيسي للقضاء على CD4 السلبية، CD8-السلبية الخلايا السلبية المزدوجة، والتي يمكن أن تسبب القتل المباشر للخلايا الإيجابية المزدوجة عند التحفيز. هذه التقنية قابلة للتطبيق مع عدة مصادر من الخلايا البشرية، بما في ذلك الخلايا الجذعية للدم والخلايا الجذعية الجنينية. يمكن تحسين الخلايا التائية غير الناضجة المشتقة من iPSC التي تم إنشاؤها بواسطة هذا الأسلوب من أجل توليد خلايا T تشبه الأساليب السذاجة للورم البشري الناضجة للاستخدام العلاجي في المستقبل.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب على المشاهد فهم كيفية توليد الإنسان iPSC المستمدة من CD8 بيتا بيتا خلايا T إيجابية واحدة باستخدام OP9 - دلتا - 1 المشتركة في الثقافة النظام.
