Apresentamos um método para gerar células-tronco pluripotentes induzidas por células-tronco derivadas do tumor cd8 alfa beta beta uni-positivo T usando o sistema de co-cultura OP9-Delta-1. Este método é uma poderosa ferramenta para a geração de células T in vitro e facilitará o desenvolvimento de células T derivadas in vitro para uso em medicina regenerativa e terapias baseadas em células. Também pode ser adaptado para a geração de outros linfócitos, como células NK.
Ao executar essa técnica, é importante pré-avaliar o lote de células FBS e passagem OP9-Delta-1 de forma consistente quando o contato citoplasmático célula-celular começar a prevenir a diferenciação celular e a senescência. Demonstrando o procedimento será a Dra. Comece verificando colônias de iPSC humanos em um microscópio estéreo e remova quaisquer áreas de diferenciação da cultura com a borda plástica de uma ponta de pipeta de 200 microliter.
Quando as colônias atingirem 0,8 a 1,2 milímetros de diâmetro, passagem os iPSCs humanos. Aspire a mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia iPSC humana suplementada com inibidor ROCK de 10 micromolar. Enrole uma ferramenta de troca de celular descartável por todo o prato em uma direção, certificando-se de manter a pressão uniforme e que toda a lâmina de rolo toca o prato da cultura.
Gire o prato de cultura 90 graus, e repita o rolamento. Confirme visualmente o corte adequado das colônias com um microscópio. Eles devem parecer quadrimestados.
Em seguida, desprendem as colônias cortadas por uma suave descarga mecânica com uma pipeta de 200 microliter. Estimar visualmente o número de aglomerados de colônias, e transferir entre 350 e 600 aglomerados para um novo prato de 10 centímetros de fibroblastos embrionários de camundongos com 10 mililitros de mídia iPSC humana fresca complementada com inibidor de ROCK. Incubar o prato durante a noite a 37 graus Celsius.
No dia seguinte, aspire a mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia iPSC humana fresca. Mude a mídia a cada um ou dois dias, dependendo da taxa de crescimento celular. Cultura as células OP9-Delta-1 em mídia OP9 a 37 graus Celsius.
Quando atingirem a confluência, aspirem a mídia e lavem as células uma vez com cinco mililitros de 1x magnésio, cálcio e PBS sem fenol. Aspire o PBS, adicione dois mililitros de 05% de trippsina-EDTA, e incuba as células por cinco minutos a 37 graus Celsius. Em seguida, adicione quatro mililitros de mídia OP9 e dissociar mecanicamente a camada celular por pipetação.
Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador de células de 100 micrômetros, e centrífuga a 300 vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Aspire o supernasce, e resuspense as células em 12 mililitros de mídia OP9. Adicione oito mililitros de mídia OP9 a cada um dos seis novos pratos de cultura celular, e placa dois mililitros da suspensão celular OP9-delta-1 em cada prato.
Balance o prato de um lado para o outro e frente para trás para garantir a distribuição uniforme das células. Incubar as células a 37 graus Celsius, e repetir a passagem quando as células atingirem a confluência. Prepare pratos OP9-Delta-1 gelatinizados uma semana antes da co-cultura com iPSCs humanos.
Adicione quatro mililitros de gelatina de 0,1% a três novos pratos de cultura celular, e incuba-os por 30 minutos a 37 graus Celsius. Após a incubação, aspire a gelatina e adicione oito mililitros de mídia OP9 a cada prato. Passagem um prato confluente de células OP9-Delta-1 para três pratos revestidos de gelatina.
Após quatro dias, adicione 10 mililitros de mídia OP9 a cada prato de células, para um total de 20 mililitros de mídia por prato. Inicie a co-cultura iPSC humana em pratos confluentes OP9-Delta-1 de sete a oito dias após a passagem das células. Aspire a mídia de um prato confluente de iPSCs humanos, e adicione 10 mililitros de mídia OP9.
Corte e desprende colônias celulares usando uma ferramenta descartável de passagem celular, e transfira 350 a 600 aglomerados de colônias cortadas para um prato OP9-Delta-1 pré-gelatinizado com 10 mililitros de mídia OP9 fresca. Arrase o prato de cultura lado a lado e frente a frente para trás para garantir até mesmo a distribuição das colônias. No dia seguinte, aspire a mídia gasta, e substitua-a por 20 mililitros de mídia OP9 fresca.
Os aglomerados humanos iPSC co-cultivados no OP9-Delta-1 por um dia devem aparecer como pequenas colônias de monocamadas redondas. No quinto dia, aspire 10 mililitros de mídia gasta, e adicione 10 mililitros de mídia OP9 fresca. As colônias começarão a se diferenciar em mesodermia primitiva, que é caracterizada por um centro escuro multicamadas.
Repita este processo no nono dia, momento em que as estruturas do centro multicamadas evoluirão para formas semelhantes a cúpulas. Colher as células progenitoras hematopoiéticas no dia 13, momento em que as estruturas são compostas de um organoide central escuro cercado por uma rede de áreas semelhantes a cúpulas. Aspire a mídia, e lave as células uma vez com cinco mililitros de 1x solução de sal balanceado hanks sem fenol com cálcio e magnésio, ou HBSS.
Após a lavagem, adicione 250 microliters de 5.000 unidades por mililitro colagenase IV a 10 mililitros de HBSS. Adicione a mistura às células e incuba-as a 37 graus Celsius por 45 minutos. Aspire a mistura HBSS-collagenase e lave as células uma vez com cinco mililitros de PBS.
Depois de lavar com PBS, adicione cinco mililitros de 0,25% trypsin-EDTA, e incuba as células a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, adicione quatro mililitros de mídia OP9 e dissocia a camada celular por pipetação para fazer uma suspensão de célula única. Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador de 100 micrômetros e centrifugar o tubo a 300 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos.
Aspire o supernasce, e resuspense as células em 10 mililitros de mídia OP9. Plaque a suspensão celular em um novo prato de cultura celular gelatinizada de 10 centímetros, e incuba-os a 37 graus Celsius por 45 minutos. Em seguida, colete quaisquer células não aderentes por pipetação suave.
Transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 50 mililitros através de um coador e centrífuga como descrito anteriormente. Em seguida, aspire o supernasce, e resuspense as células em 10 mililitros de mídia de diferenciação. Coloque a suspensão da célula em um novo prato confluente OP9-Delta-1.
Passe as células no dia 16 de acordo com as instruções do manuscrito, e continue a passar as células não aderentes a cada cinco ou sete dias depois. Após 35 dias de diferenciação, enriqueça a população celular CD4 positivo pelo isolamento de contas magnéticas CD4 de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, resuspenque as células em mídia OP9, e placa um mililitro de suspensão celular em cada poço de uma cultura tecidual, fundo plano, placa de 24 poços de confluente OP9-Delta-1.
Estimule as células adicionando 100 unidades internacionais de IL-2 humanos, cinco nanogramas de IL-7 humanos, 500 nanogramas de anticorpos CD3 anti-humanos, e dois microgramas de anticorpos CD28 anti-humanos para cada poço. Após quatro a sete dias, as células podem ser coletadas para análise suplementar. Após a cultura em OP9-Delta-1 não gelatinizada na presença de fatores de células-tronco humanas, flt3-ligantes humanos e interleucina humana-7, progenitores hematopoiéticos se diferenciam em células de linhagem T CD3, CD7, CD4 e CD8 duplamente positivas, a maioria das quais expressavam receptores de células T específicos para o epítope MART1.
Quando o CD4, células T cd8 duplo-positivas foram estimuladas com anticorpos anti-humanos CD3 e CD28 na presença de interleucina humana-7 e 2, o número de células CD3-positivas CD8 alfa beta single-positivo aumentou e permaneceu específico para o epítope MART1, confirmando a preservação de sua especificidade de antígeno herdado. Um ensaio elispot revelou que quando cultivadas na presença de peptídeo MART1, as células T beta alfa beta monopositivos derivadas do iPSC secretam maiores quantidades de gama interferon em comparação com as células T alfa a granel e CD8. Nenhuma expressão gama de interferon foi detectada apenas para células T e células que apresentam antígenos, demonstrando que as células T derivadas do T-iPSC humanos são específicas de antígeno e funcionais.
Um passo importante neste método é o enriquecimento de contas magnéticas CD4 para eliminar células CD4-negativas, CD8-negativos duplo-negativos, que podem causar morte direta de células dupla-positivas após a estimulação. Esta técnica é aplicável para uso com várias fontes de células humanas, incluindo células-tronco hematopoiéticas e células-tronco embrionárias. Células T imaturas derivadas do iPSC geradas por este método poderiam ser melhoradas ainda mais para a geração de células T ingênuas específicas do tumor humano maduro para uso terapêutico futuro.
Depois de assistir a este vídeo, o espectador deve entender como gerar células T beta alfa beta monopositivos do iPSC usando o sistema de cocultura OP9-Delta-1.
