Presentamos un método para generar células T monopositivas de antígeno tumorario derivado de células madre de células madre inducidas por humanos mediante el uso de un sistema de cultivo conjunto OP9-Delta-1. Este método es una poderosa herramienta para la generación in vitro de células T y facilitará el desarrollo de células T derivadas in vitro para su uso en medicina regenerativa y terapias basadas en células. También se puede adaptar para la generación de otros linfocitos, como las células NK.
Al realizar esta técnica, es importante preevaluar el lote de células FBS y de paso OP9-Delta-1 consistentemente cuando el contacto citoplasmático de célula a célula comienza a prevenir la diferenciación celular y la senescencia. Meghan Good, un becario de oncología quirúrgica de mi equipo. Comience por revisar las colonias humanas de iPSC en un microscopio estéreo y elimine cualquier área de diferenciación del cultivo con el borde plástico de una punta de pipeta de 200 microlitros.
Cuando las colonias alcancen 0,8 a 1,2 milímetros de diámetro, pasa por los iPSC humanos. Aspirar los medios gastados y añadir 10 mililitros de medios iPSC humanos complementados con inhibidores de ROCK de 10 micromolares. Enrolle una herramienta de paso de celda desechable a través de todo el plato en una dirección, asegurándose de mantener una presión uniforme y de que toda la hoja del rodillo toque el plato de cultivo.
Gire el plato de cultivo 90 grados, y repita el rollo. Confirmar visualmente el corte adecuado de las colonias con un microscopio. Deberían aparecer atado.
A continuación, desensabrar las colonias cortadas mediante un suave lavado mecánico con una pipeta de 200 microlitros. Estimar visualmente el número de grumos de colonias, y transferir entre 350 y 600 grumos a un nuevo plato de 10 centímetros de fibroblastos embrionarios de ratón con 10 mililitros de medios iPSC humanos frescos complementados con inhibidores de ROCK. Incubar el plato durante la noche a 37 grados centígrados.
Al día siguiente, aspirar los medios gastados, y añadir 10 mililitros de medios iPSC humanos frescos. Cambie los medios cada uno o dos días, dependiendo de la tasa de crecimiento celular. Cultivo de las células OP9-Delta-1 en medios OP9 a 37 grados Celsius.
Cuando alcancen la confluencia, aspire los medios y lave las células una vez con cinco mililitros de 1x de magnesio, calcio y PBS libre de rojo fenol. Aspirar el PBS, añadir dos mililitros de 05%trypsin-EDTA, e incubar las células durante cinco minutos a 37 grados centígrados. A continuación, agregue cuatro mililitros de medios OP9 y disocia mecánicamente la capa celular pipeteando.
Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros a través de un colador celular de 100 micrómetros, y centrifugar a 300 veces g a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 12 mililitros de medios OP9. Agregue ocho mililitros de medios OP9 a cada uno de los seis nuevos platos de cultivo celular, y vajilla dos mililitros de la suspensión de células OP9-delta-1 en cada plato.
Mece el plato de lado a lado y de adelante hacia atrás para asegurar una distribución uniforme de las células. Incubar las células a 37 grados centígrados, y repetir el paso cuando las células alcanzan la confluencia. Preparar platos gelatinizados OP9-Delta-1 una semana antes de la co-cultura con iPSC humanos.
Añadir cuatro mililitros de 0.1% gelatina a tres nuevos platos de cultivo celular, e incubarlos durante 30 minutos a 37 grados Celsius. Después de la incubación, aspirar la gelatina, y añadir ocho mililitros de medios OP9 a cada plato. Pasaje de un plato confluente de las células OP9-Delta-1 a tres platos recubiertos con gelatina.
Después de cuatro días, agregue 10 mililitros de medios OP9 a cada plato de células, para un total de 20 mililitros de medios por plato. Comience la co-cultura humana iPSC en platos confluentes OP9-Delta-1 de siete a ocho días después de pasar las células. Aspirar los medios de un plato confluente de iPSC humanos, y añadir 10 mililitros de medios OP9.
Corte y desprenda colonias celulares usando una herramienta de desprendimiento celular desechable, y transfiera de 350 a 600 grupos de colonias cortadas a un plato pre-gelatinizado OP9-Delta-1 con 10 mililitros de medios OP9 frescos. Rock el plato de cultivo de lado a lado y de adelante hacia atrás para asegurar una distribución uniforme de las colonias. Al día siguiente, aspirar los medios gastados y reemplazarlo con 20 mililitros de medios nuevos OP9.
Los grupos humanos iPSC co-cultivados en OP9-Delta-1 durante un día deben aparecer como colonias pequeñas, redondas y monocapas. En el quinto día, aspira 10 mililitros de medios gastados, y añade 10 mililitros de medios NUEVOS OP9. Las colonias comenzarán a diferenciarse en mesodermo primitivo, que se caracteriza por un centro oscuro multicapa.
Repita este proceso en el día nueve, momento en el que las estructuras centrales multicapa evolucionarán en formas similares a las cúpulas. Cosecha las células progenitoras hematopoyéticas el día 13, momento en el que las estructuras se componen de un organoide central oscuro rodeado por una red de áreas tipo cúpula. Aspirar los medios y lavar las células una vez con cinco mililitros de solución de sal balanceada de Hanks sin fenol 1x con calcio y magnesio, o HBSS.
Después del lavado, agregue 250 microlitros de 5.000 unidades por mililitro de colagenasa IV a 10 mililitros de HBSS. Agregue la mezcla a las células e iclee a 37 grados centígrados durante 45 minutos. Aspirar la mezcla HBSS-colagenasa, y lavar las células una vez con cinco mililitros de PBS.
Después de lavar con PBS, añadir cinco mililitros de 0.25%trypsin-EDTA, e incubar las células a 37 grados Celsius durante 20 minutos. A continuación, agregue cuatro mililitros de medios OP9 y disocia la capa celular pipeteando para hacer una suspensión de una sola celda. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros a través de un colador de 100 micrómetros, y centrifugar el tubo a 300 veces g y cuatro grados celsius durante cinco minutos.
Aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 10 mililitros de medios OP9. Plato de la suspensión celular en un nuevo plato de cultivo celular gelatinizado de 10 centímetros, e incubarlos a 37 grados Celsius durante 45 minutos. Luego, recoja las células no adherentes por pipeteo suave.
Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mililitros a través de un colador y centrífuga como se describió anteriormente. Luego, aspirar el sobrenadante, y resuspender las células en 10 mililitros de medios de diferenciación. Plato de la suspensión celular en un nuevo plato confluente OP9-Delta-1.
Pasar las celdas el día 16 de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y continuar pasando las células no adherentes cada cinco a siete días a partir de entonces. Después de 35 días de diferenciación, enriquecer la población de células CD4 positivas por aislamiento magnético de perlas CD4 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Luego, resuspender las células en medios OP9, y placa un mililitro de suspensión celular en cada pocómo de un cultivo de tejido, fondo plano, placa de 24 pocillos de confluente OP9-Delta-1.
Estimular las células mediante la adición de 100 unidades internacionales de IL-2 humano, cinco nanogramos de IL-7 humano, 500 nanogramos de anticuerpos antihumanos CD3, y dos microgramos de anticuerpos antihumanos CD28 a cada pozo. Después de cuatro a siete días, las células se pueden recolectar para su análisis posterior. Después del cultivo en OP9-Delta-1 no gelatinizado en presencia de células de linaje de células madre humanas, FLT3-ligand humano e interleucina-7 humana, los progenitores hematopoyéticos se diferenciaron en células de linaje T DE doble positivo CD3, CD7, CD4 y CD8, la mayoría de las cuales expresaron receptores de células T específicos del epitopo MART1.
Cuando las células T CD4, CD8 doble positivas fueron estimuladas con anticuerpos antihumanos CD3 y CD28 en presencia de interleucina-7 y 2 humanas, el número de células monoémicas CD8 positivas CD8 alfa beta aumentó y siguió siendo específico para el epitopo MART1, confirmando la preservación de su especificidad de antígeno heredado. Un ensayo de ELISpot reveló que cuando se cultiva en presencia de péptido MART1, células T monopositivas CD8 alfa beta de origen humano secretan mayores cantidades de gamma de interferón en comparación con las células T monopositivas alfa a granel y CD8 alfa. No se detectó ninguna expresión gamma de interferón solo para las células T y las células que presentan antígenos, lo que demuestra que las células T derivadas de T-iPSC humanas son específicas del antígeno y funcionales.
Un paso importante en este método es el enriquecimiento magnético de cuentas CD4 para eliminar las células de doble negativo CD8 negativos CD4, que pueden causar la muerte directa de células de doble positivo al estimulación. Esta técnica es aplicable para su uso con varias fuentes de células humanas, incluyendo células madre hematopoyéticas y células madre embrionarias. Células T inmaduras derivadas de iPSC generadas por este método podrían mejorarse aún más para la generación de células T ingenuas similares a antígenos humanos maduros para uso terapéutico futuro.
Después de ver este video, el espectador debe entender cómo generar células T monopositivas CD8 alfa beta de humanos que utilizan el sistema de co-cultivo OP9-Delta-1.
