OP9-Delta-1 공동 배양 시스템을 이용하여 인간 유도만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 CD8 알파 베타 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 제시한다. 이 방법은 체외 T 세포 생성을 위한 강력한 도구이며 재생 의학 및 세포 기반 치료에 사용하기 위한 체외 유래 T 세포의 개발을 용이하게 할 것이다. 그것은 또한 NK 세포 같이 그밖 림프구의 생성을 위해 적응될 수 있습니다.
이 기술을 수행할 때, 세포 세포 세포 접촉이 세포 분화 및 노화를 방지하기 시작할 때 지속적으로 FBS 및 통과 OP9-Delta-1 세포를 많이 미리 평가하는 것이 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 우리 팀의 외과 종양학 동료인 Meghan Good 박사가 될 것입니다. 스테레오 현미경으로 인간 iPSC 식민지를 검사하고 200 마이크로 리터 파이펫 팁의 플라스틱 가장자리로 문화에서 분화의 모든 영역을 제거합니다.
식민지가 직경 0.8 내지 1.2 밀리미터에 도달하면 인간 iPSC를 통과합니다. 소비 된 미디어를 흡인하고 10 마이크로 몰라 ROCK 억제제로 보충 된 인간 iPSC 미디어의 10 밀리리터를 추가하십시오. 일회용 셀 패세이징 도구를 한 방향으로 롤하여 균일한 압력을 유지하고 전체 롤러 블레이드가 배양 접시에 닿도록 합니다.
문화 접시를 90도 회전시키고 롤링을 반복합니다. 현미경으로 식민지의 적절한 절단을 시각적으로 확인합니다. 그들은 체크 표시 해야 합니다.
그런 다음 200 마이크로리터 파이펫으로 부드러운 기계적 플러싱으로 절단 된 식민지를 분리합니다. 시각적으로 식민지 덩어리의 수를 추정하고, 350과 600 덩어리 사이의 전송 마우스 배아 섬유 아세포의 새로운 10 센티미터 접시에 신선한 인간 iPSC 미디어의 10 밀리리터 바위 억제제로 보충. 하룻밤 동안 37°C에서 요리를 배양하십시오.
다음 날, 소비 된 미디어를 흡인하고 신선한 인간 iPSC 미디어의 10 밀리리터를 추가합니다. 세포 증가율에 따라 1~2일마다 미디어를 변경합니다. OP9 배지에서 OP9-델타-1 세포를 섭씨 37도에서 배양합니다.
그들은 합류에 도달하면, 미디어를 흡인하고, 1 x 마그네슘, 칼슘, 페놀 무적 PBS의 다섯 밀리리터와 한 번 세포를 씻어. PBS를 흡인하고, 05%의 트립신-EDTA의 2밀리리터를 추가하고, 섭씨 37도에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 OP9 미디어의 4 밀리리터를 추가하고 파이펫팅을 통해 셀 층을 기계적으로 분리합니다.
셀 서스펜션을 100마이크로미터 세포 스트레이너를 통해 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고, 원심분리기는 섭씨 4도에서 섭씨 4도에서 300배에서 5분간 전달한다. 슈퍼나탈자를 흡인시키고 OP9 미디어의 12밀리리터에서 세포를 재보힙한다. OP9 배지 8밀리리터를 6개의 새로운 세포 배양 접시에 추가하고 OP9-델타-1 셀 서스펜션의 2밀리리터를 각 접시에 접시에 넣습니다.
접시 측면을 좌우로 흔들어 세포의 분포도 보장합니다. 세포가 섭씨 37도에서 배양하고 세포가 합류에 도달하면 통과를 반복합니다. 인간 iPSC와 공동 문화전에 1주일 전에 젤라틴 OP9-Delta-1 요리를 준비합니다.
3개의 새로운 세포 배양 접시에 0.1%젤라틴의 4밀리리터를 추가하고, 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 젤라틴을 흡인하고 각 접시에 OP9 미디어 8 밀리리터를 추가합니다. OP9-Delta-1 셀의 컨물리 요리 1개를 젤라틴 코팅 된 요리 3 개에 통과시하십시오.
4일 후, 각 셀 접시에 OP9 미디어 10 밀리리터를 추가하여 접시당 총 20밀리리터의 미디어를 사용할 수 있습니다. OP9-Delta-1 컨서우휴 요리에서 세포를 통과한 지 7~8일 후에 인간 iPSC 공동 배양을 시작합니다. 인간 iPSC의 컨물리 요리에서 미디어를 흡인하고 OP9 미디어의 10 밀리리터를 추가합니다.
일회용 세포 패싱 도구를 사용하여 세포 식민지를 잘라내고 분리하고 350~600덩어리의 절단 식민지를 신선한 OP9 미디어 10밀리리터가 있는 사전 젤라틴 OP9-Delta-1 접시에 옮길 수 있습니다. 식민지의 분포를 보장하기 위해 앞뒤로 문화 접시 측면을 바위. 다음 날, 소비 된 미디어를 흡인하고 신선한 OP9 미디어의 20 밀리리터로 대체하십시오.
하루 동안 OP9-Delta-1에서 공동 배양된 인간 iPSC 덩어리는 작고 둥근 단층 식민지로 나타나야 합니다. 5일째에는 소비된 미디어 10밀리리터를 흡기하고 신선한 OP9 미디어 10밀리리터를 추가합니다. 식민지는 다층 어두운 중심이 특징인 원시 적 중구로 구별되기 시작합니다.
9일째에 이 과정을 반복하며, 이 시점에서 다층 중심 구조는 돔 모양으로 진화합니다. 13일째에 조혈 선조 세포를 수확하여, 이 시점에서 구조물은 돔과 같은 영역의 네트워크로 둘러싸인 어두운 중앙 오르가노이드로 구성됩니다. 미디어를 흡인하고, 칼슘과 마그네슘 또는 HBSS를 함유한 1x 페놀 무적행크스의 균형 잡힌 소금 용액 5개로 세포를 한 번 씻으세요.
세척 후, HBSS의 10 밀리리터에 밀리리터당 5, 000 단위 콜라게나아제 IV의 250 마이크로리터를 추가합니다. 혼합물을 세포에 추가하고 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다. HBSS 콜라게나아제 혼합물을 흡인시키고, PBS의 5밀리리터로 세포를 한 번 씻으세요.
PBS로 세척한 후 5밀리리터를 0.25%의 트립신-EDTA로 추가하고 20분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 그런 다음 OP9 미디어의 4 밀리리터를 추가하고 파이펫팅하여 세포 층을 분리하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다. 셀 서스펜션을 100마이크로미터 스트레이너를 통해 50밀리리터 원내 튜브로 옮기고, 튜브를 300배, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다.
슈퍼나탈자를 흡인시키고 OP9 미디어의 10밀리리터에서 세포를 재보힙한다. 새로운 젤라틴 10센티미터 세포 배양 접시에 세포 현탁액을 접시에 접시, 45 분 동안 섭씨 37도에서 배양. 그런 다음 부드러운 파이펫팅으로 비 부착 셀을 수집합니다.
세포 현탁액을 스트레이너를 통해 50 밀리리터 원내 튜브로 옮기고, 원심분리기는 이전에 설명된 바와 같이 전달한다. 그런 다음, 상체를 흡인하고, 분화 매체의 10 밀리리터에서 세포를 재일시 중단한다. 셀 서스펜션을 새로운 OP9-Delta-1 컨서적 접시에 접시를 놓습니다.
원고 의 지시에 따라 16 일에 세포를 통과하고 그 후 5 ~ 7 일마다 비 부착 세포를 계속 전달합니다. 35일 분화 후 제조업체의 프로토콜에 따라 CD4 자기 비드 절연에 의해 CD4 양성 세포 집단을 풍부하게 한다. 이어서 OP9 배지에서 세포를 재중단시키고, 1밀리리터의 세포 현탁액을 조직 배양, 평평한 바닥, 24웰 플레이트의 OP9-Delta-1로 플레이트한다.
인간 IL-2의 100개의 국제 단위, 인간 IL-7의 5나노그램, 항인간 CD3 항체의 500 나노그램, 그리고 각 우물에 항인간 CD28 항체의 2마이크로그램을 추가하여 세포를 자극합니다. 4~7일 후에는 추가 분석을 위해 세포를 수집할 수 있다. 인간 줄기 세포 인자, 인간 FLT3-리간드 및 인간 인터류킨-7의 존재에 비젤라틴화된 OP9-Delta-1에 대한 배양 후, 조혈 선조는 CD3, CD7, CD4 및 CD8 이중 양성 T 계보 세포로 분화되었으며, 그 중 대부분은 MART1 epitope에 특이적으로 발현된 T 세포 수용체를 발현하였다.
CD4, CD8 이중 양성 T 세포가 인간 인터류키인-7 및 2의 존재 속에서 항인간 CD3 및 CD28 항체로 자극되었을 때, CD3 양성 CD8 알파 베타 단일 양성 세포의 수가 증가하고 MART1 에피토프에 대해 특이성을 유지하여 유전된 항원 특이성의 보존을 확인하였다. ELISpot 분석결과 MART1 펩타이드의 존재시 배양시 인간 iPSC 유래 CD8 알파 베타 단일 양성 T 세포가 벌크 및 CD8 알파 단일 양성 T 세포모두에 비해 더 많은 양의 인터페론 감마를 분비한다고 밝혔다. 인간 T-iPSC 유래 T 세포가 항원 특이적이고 기능적임을 입증하면서 T 세포 및 항원 제시 세포만으로는 인터페론 감마 발현이 검출되지 않았다.
이 방법의 중요한 단계는 CD4 음성, CD8 음성 이중 음수 세포를 제거하기 위해 CD4 자기 비드 농축으로 자극 시 이중 양성 세포의 직접 적인 살해를 일으킬 수 있습니다. 이 기술은 조혈 줄기 세포 및 배아 줄기 세포를 포함하여 인간 세포의 몇몇 근원과 함께 사용하기 위하여 적용됩니다. iPSC 유래 미성숙 T 세포는 향후 치료용 으로 성숙한 인간 종양 항원 특이적 순진한 T 세포의 생성을 위해 더욱 개선될 수 있다.
이 비디오를 시청한 후 시청자는 OP9-Delta-1 공동 배양 시스템을 사용하여 인간 iPSC 유래 CD8 알파 베타 단일 양성 T 세포를 생성하는 방법을 이해해야 합니다.
