Hayvan testlerini azaltmak ve NH testinin değişkenliği nedeniyle WHO, kuduz aşısının gücünü değerlendirmek için in vitro yaklaşımlar geliştirmeye teşvik eder. Bu ELISA testi glikoproteinin immünojenik formunu tanımada klasik NH testi ile iyi bir uyum gösterir, yüksek duyarlılık gösterir ve sadece bir gün içinde yapılabilir. Kuduz aşısı potensinin ELISA ile in vitro olarak değerlendirilmesi in vivo NH testine alternatiftir.
Üreticiler ve ulusal kontrol laboratuvarları tarafından teşvik edilmektedir. Her seyreltme için çoğaltılmış hacimleri çoğaltmak ve yıkamadan sonra plakayı iyi kurutmak, bu prosedüre başlamak tan kaçınmak için, tek kullanımlık palto, eldiven, maske ve gözlük gibi yeterli kişisel koruma ekipmanı takmak çok önemlidir. Kirlenmiş maddeleri dekontaminasyon için 30 dakika boyunca %2,6 sodyum hipoklorit çözeltisi içine batırarak tedavi edin.
Sonra, 96-iyi immünoassay plaka yola ve her kuyuya karbonat tampon seyreltilmiş monoklonal antikor 200 mikrolitre ekleyin. Plakayı yapışkan filmle kaplayın ve mikro plakayı nemli bir ortamda üç saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra dikkatlice aspire ve% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya kuyu içeriği aktarın.
Mikroplakayı ters çevirin ve oda sıcaklığında emici kağıda beş dakika kurutun. İlk olarak, her kuyuya 300 mikrolitre pasivasyon tamponu ekleyin. Plakayı yapışkan filmle kaplayın ve 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra kuyunun içindekileri %2.6 sodyum hipoklorit solüsyonu içeren bir ekive aktarın. Plakayı yıkamak için, her kuyuya 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin. Daha sonra dikkatlice aspire ve% 2.6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya iyi içeriği aktarın.
Hassas plakayı kapsamlı bir şekilde yıkamak için bu yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Bundan sonra, mikroplaka ters ve bir dakika oda sıcaklığında emici kağıt parçası üzerinde kurumasına izin. Kuduz virüsü glikoproteininin son konsantrasyonunun mililitrede 10 mikrogram olması gibi bir mililitre distile suda referans aşıyı yeniden kurun.
Mililitre başına bir mikrogram kuduz virüsü glikoprotein konsantrasyonuna ulaşmak için seyrelticide yeniden oluşturulmuş referans aşının 10 kat seyreltilmesini hazırlayın. Daha sonra, metin protokolütabloda belirtildiği gibi seyreltme bu referans aşı altı seri iki kat seyreltme gerçekleştirin. Yinelenen kuyularda seyreltici 200 mikrolitre dağıtın kör bir kontrol olarak hizmet ve çoğaltılmış her referans aşı seyreltme için iyi başına 200 mikrolitre.
Daha sonra seyreltici de test edilen aşının 10 kat seyreltilmesini hazırlayın ve metin protokolünün ikinci tablolarında belirtildiği gibi seyreltici olarak test edilen aşının yedi iki kat seri seyreltmesini hazırlayın. Test edilen her aşı seyreltme 200 mikrolitresini mikroplakanın her kuyuya çoğaltılması için dağıtın. Mikro plakayı yapışkan filmle kaplayın ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Bundan sonra, filmi kaldırın. Aspire dikkatle ve% 2.7 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya her kuyunun içeriğini aktarın. Plakayı yıkamak için, her kuyuya 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın.
Bağlanmamış antijeni çıkarmak ve kaplanmış antikora bağlı G-protein düzelticileri korumak için yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Yıkanmış mikroplakaters ve bir dakika oda sıcaklığında emici kağıt parçası üzerinde kurumasına izin. Daha sonra her kuyuya seyreltici olarak D1 monoklonal antikor etiketli peroksidaz önerilen seyreltme 200 mikrolitre dağıtmak.
Mikro plakayı yapışkan filmle kaplayın ve bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra filmi çıkarın, dikkatlice aspire edin ve her kuyunun içeriğini %2,6 sodyum hipoklorit çözeltisi içeren bir alıcıya aktarın. Mikro plakayı yıkamak için, her kuyuya 300 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin.
Aspire dikkatle ve her kuyunun içeriğini bir alıcıya transfer 2.6% sodyum hipoklorit çözeltisi içeren. Bağlı olmayan peroksidaz etiketli antikorkaldırmak için bu yıkama işlemini beş kez daha tekrarlayın. Yıkanmış mikroplakaters ve bir dakika oda sıcaklığında emici kağıt parçası üzerinde kurumasına izin.
Daha sonra, her kuyuya 200 mikrolitre substrat-kromojen çözeltisi dağıtın. Mikro plakayı filmle kapatın ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 50 mikrolitre durdurma çözeltisi ekleyin.
Dikkatlice mikroplakanın alt silin ve spektrofotometre yerleştirin. Kullanılan tüm kuyular için optik yoğunluğu 492 nanometre olarak belirleyin. Bu verileri çözümleme için bir elektronik tablo dosyasında toplayın.
Bundan sonra, hem referans aşı eğrisi hem de metin protokolünde belirtildiği gibi optik yoğunluk değerleri için çizimler oluşturun. Bu çalışmada kuduz aşısının gücünü değerlendirmek için in vitro ELISA testi kullanılmıştır. Tipik bir deneyden temsili optik yoğunluk değerleri burada gösterilmiştir.
Bu değerler, referans aşının dikey eksenüzerindeki farklı seyreltmeleri ve glikoproteinin yatay eksen üzerindeki konsantrasyonu için ortalama optik yoğunluğu çizerek referans aşı eğrisini çizmek için kullanılır. Test edilen aşının glikoprotein içeriği bu eğri kullanılarak tahmin edilir. Değerlendirme, referans aşı eğrisinin astar alanında ortalama optik yoğunluk değerine sahip seyreltmeler için kesindir.
Bir-40 seyreltme dikkate alınarak, x ekseni üzerinde OD 1534 dikey projeksiyon mililitre başına 500 nanogram karşılık gelir. Yani test edilen aşının mililitreglikoprotein başına 20 mikrogram olduğu tahmin ediliyor. In vitro potens kurulduğunda, uluslararası birimlerde kalibre referans altı WHO uluslararası standart için test aşısı karşılaştırmak için gereklidir.
Aynı yöntem klasik olarak daha değişken veteriner aşıları kullanılanlar da dahil olmak üzere daha fazla aşı suşlarının tespitini büyütmek için diğer antikorlar ile birlikte kullanılabilir. Antikorlar da at veya insan serumantirabis antikorların titrasyonu için rekabet içinde kullanılabilir. İnaktive olmayan aşılar veya virüsler ile önlem alınmalıdır.
Kişisel koruyucu ekipman kullandığınızdan, eldiven kullandığınızdan ve her şeyi düzgün bir şekilde dezenfekte etmeye özentin. Ayrıca, kanserojen ve asidik sodyum hipoklorit çözeltisi ile tabletler ile dikkatli olun.
