Küresel olarak fibroblastların kültüre sülatılması tümör dokusunu sert plastik üzerinde yaygın olarak kullanılan 2B sistemden çok daha iyi özetler. Tümör benzeri bir ortamda fibroblastların farklılaşmasını incelemenizi sağlar. Bu yöntemde hücre kültürü plastik çalışmalarının sertliği fibroblast farklılaşmasını etkilemez.
Bunun yerine, fibroblast tümör indüklenen farklılaşma hücre matris etkileşimetkisi in vitro analiz edilebilir. Bu prosedüre başlamak için, MEM%1 ısı inaktive FBS ve % 1 penisilin streptomisin ile desteklenen hücre kültürü ortamı elde edin. Ayrıca, mililitre metilselüloz çözeltisi başına altı miligram elde.
Metilselülozun bir kısmını hücre kültürü ortamının üç parçasıyla karıştırarak küresel oluşum çözeltisini hazırlayın. Küresel formasyon çözeltisinde metin protokolünde listelenen taze çözülmüş ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastları veya diğer hücre tiplerini yeniden askıya alın. Sitokinler veya integrin inhibitörleri çalışmaya dahil edilirse, bu bileşikleri hücre süspansiyonuna ekleyerek bu bileşikleri oluşumu sırasında küresel lere yerleştirin.
Uygun olduğunda, ölümsüzleştirilmiş normal fibroblastlarda farklılaşmayı tetiklemek için inhibitör bileşikleri ve tgf beta bir mililitre başına 10 nanogram ekleyin. Yuvarlak bir alt 96 çok kuyulu plaka her kuyuiçine küresel oluşum çözeltisi 100 mikrolitre dağıtın. Pipet her kuyuda çözeltiyi birkaç kez karıştırıp karıştırın.
Daha sonra, hücre kültürü kuluçka makinesinde plakayı 37 santigrat derecede %5 karbondioksitle 24 saat boyunca kuluçkaya yatırarak her kuyuda bir küresel oidin oluşmasına izin verin. İlk olarak, deliği büyütmek için pipet ucunu kesin. Kuluçka tamamlandıktan sonra, küresel leri deneysel durum başına 1,5 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne veya analiz edilecek protein başına toplamak için bu kesme pipeti kullanın.
Yaklaşık 30 ila 60 saniye için 1000 kez G olarak siperoidler santrifüj. Peletli küresel leri rahatsız etmemek için boru lama yaparak süpernatant içeren metilselülozları dikkatlice çıkarın. Küresel lerin reaksiyon tüplerine aktarılmasında özel dikkat edilmelidir.
Ucu keserek makas sürüklenme kuvvetleri olmadığından emin olun. Ayrıca tüm küresel leri toplamanız da önemlidir. Yıkama adımı sırasında, aspirasyon ile küresel leri kaybetmeyin emin olun.
Küresel yıkamak için bir X PBS 50 mikrolitre ekleyin. 30-60 saniye için 1000 kez G santrifüj. Daha sonra pipetleme yaparak PBS'yi dikkatlice çıkarın.
Lekelenecek proteine bağlı olarak, küresel leri oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve PBS'nin 50 mikrolitresi ile düzeltin. Daha önce açıklandığı gibi PBS ile spheroids yıkayın. Hücreleri %0.1 triton X ve PBS ile oda sıcaklığında dört dakika geçirin.
Daha sonra, pbs daha önce açıklandığı gibi üç kez spheroids yıkayın. Sferoidlere %5 FBS ve %2 BSA içeren PBS ekleyin ve spesifik olmayan protein etkileşim sitelerini engellemek için oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Şimdi, küresel leri 30 mikrolitre primer antikor ve PBS ile %2.5 FBS ve %1 BSA ile bir gecede dört derece yekponi ile kuluçkaya yatırın.
Ertesi gün, pbs üç kez daha önce açıklandığı gibi spheroids yıkayın. Bundan sonra, 30 mikrolitre sekonder antikor ve %2.5 FBS ve %1 BSA ile 90 dakika oda sıcaklığında küresel leri kuluçkaya yatırın. Daha önce açıklandığı gibi PBS üç kez spheroids yıkayın.
Daha sonra, oda sıcaklığında dört dakika boyunca Dappy boyama çözeltisi 30 mikrolitre ile hücreleri kuluçka. Daha önce açıklandığı gibi PBS bir kez spheroids yıkayın. Cam pasteur pipetkullanarak, bir cam slayt ve PBS bir damla üzerine küresel yerleştirin.
Floresan mikroskobu ile küresel leri 10 kat büyütme ile görüntülemek için lazer tarama mikroskobu kullanın. Z yığınının farklı optik düzlüklerinde küreseloidin farklı optik kesitini alın. Normal pankreas fibroblastlarının homo sferoidlerinin, ölümsüzleşmiş kanser ilişkili fibroblastların homo sferoidlerine göre immünoresan boyamasının temsili bir görüntüsü, farklılaşmış hücrelerdeki alfa üç alt birimi için artan bir sinyal göstermektedir.
Daha sonra sferoiddeki hücrelerin floresan sinyali 3D küreseloidin Z destesi görüntüleri ile ölçülür ve integrin alfa üç alt birim geninin transkripsiyonel seviyeleri qPCR tarafından belirlenir. Tüm bu sonuçlar integrin alfa üç normal muadili ile karşılaştırıldığında ölümsüzleşmiş kanser ilişkili fibroblastlar upregulated olduğunu göstermektedir. Bu integrin alfa üç beta bir pankreas fibroblastlar farklılaşma için bir belirteç olarak kabul edilebilir kanıtlıyor.
Bu yöntem ideal olarak genellikle ekstra hücre matris sertliği hücre kaderini belirler organlar ve kanser kitleleri bulunan öz doku kapitülya uygundur. Spheroids kültürü miktar gerçek zamanlı PCR ve tam sitometri gibi küresel dissosilasyon sonra diğer analitik tahliller ile kombine edilebilir çok yönlü bir modeldir. Küresel lerin fiksasyonunda kullanılan paraformaldehit tehlikeli bir kimyasal maddedir.
Koruma için eldiven ve göz aşınması giyilmelidir.
