스페로이드에서 섬유아세포를 배양하면 종양 조직을 뻣뻣한 플라스틱에 일반적으로 사용되는 2D 시스템보다 훨씬 더 잘 배양합니다. 그것은 종양 같이 환경에서 섬유아세포 분화를 연구하는 것을 허용합니다. 이 방법에서, 세포 배양 플라스틱 작업의 강성은 실제로 섬유 아세포 분화에 영향을 미치지 않습니다.
대신, 섬유아세포의 종양 유도 분화에 세포 매트릭스 상호 작용의 영향은 시험관내에서 분석될 수 있다. 이 절차를 시작하려면, 1 %의 열 비활성화 FBS와 1 %페니실린 연쇄 상균절제술로 보충 MEM인 세포 배양 매체를 가져옵니다. 또한 밀리리터 메틸셀룰로오스 용액당 6밀리그램을 획득하십시오.
메틸셀룰로오스의 한 부분을 세포 배양 매체의 3부와 혼합하여 스페로이드 형성 용액을 준비한다. 스페로이드 형성 용액의 텍스트 프로토콜에 나열된 것으로 새로 해동된 불멸의 정상 섬유아세포 또는 기타 세포 유형을 다시 중단합니다. 사이토카인 또는 인테그린 억제제가 연구에 포함된 경우, 이러한 화합물을 세포 현탁액에 추가하여 형성 시 스페로이드에 담근다.
적절 한 경우, 함께 억제제 화합물을 추가 10 TGF 베타 하나의 밀리 리터 당 나노 그램 불멸 의 정상적인 섬유 아 세포에서 분화를 트리거. 스페로이드 형성 용액 100마이크로리터를 라운드 하단 96 멀티웰 플레이트의 각 웰에 분배합니다. 혼합각 우물의 용액을 여러 번 위아래로 피펫합니다.
이어서, 세포 배양인인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 24시간 동안 배양하여 각 우물에서 하나의 스페로이드가 형성되도록 한다. 먼저 파이펫 팁의 끝을 잘라 오리피스를 확대합니다. 배양이 완료된 후, 이 컷 파이펫을 사용하여 스페로이드를 실험 조건당 또는 단백질당 1개의 1.5 밀리리터 반응 튜브로 수집하여 분석한다.
스페로이드를 약 30~60초 동안 1000배 G로 원심분리합니다. 조심스럽게 펠릿 스페로이드를 방해하지 않도록 파이펫팅에 의해 상체가 함유 된 메틸 셀룰로오스를 제거합니다. 스페로이드를 반응 튜브로 옮길 때 특별한 주의를 기울여야 한다.
팁을 절단하여 가위 드리프트 힘이 없는지 확인합니다. 모든 스페로이드를 수집하는 것도 중요합니다. 세탁 단계에서 포부로 스페로이드를 잃지 않도록 하십시오.
스페로이드를 세척하려면 X PBS 1개 50마이크로리터를 추가합니다. 30~60초 동안 1000배 G의 원심분리기. 그런 다음 파이펫팅으로 PBS를 조심스럽게 제거합니다.
염색할 단백질에 따라 실온에서 20분 동안 4%의 파라포름알데히드와 PBS의 50마이크로리터로 스페로이드를 고정합니다. 이전에 설명한 대로 PBS로 스페로이드를 세척하십시오. 0.1%트리톤 X 및 PBS로 세포를 실내 온도에서 4분 동안 투과화합니다.
이어서, PBS에서 스페로이드를 세 번 세척하여 이전에 설명한 대로 한다. 5%FBS와 2%BSA를 함유한 PBS를 스페로이드에 추가하고 1시간 동안 실온에서 배양하여 비특정 단백질 상호 작용 부위를 차단합니다. 지금, 1 차적인 항체및 PBS의 30 마이크로리터와 2.5% FBS 및 1%BSA를 하룻밤 동안 섭씨 4도에 가진 spheroids를 배양합니다.
다음 날, 이전에 설명한 대로 PBS에서 스페로이드를 세 번 세척한다. 그 후, 90분 동안 실온에서 2.5%의 FBS와 1%BSA를 갖춘 30개의 이차 항체 및 PBS마이크로리터로 스페로이드를 배양한다. 이전에 설명한 대로 PBS에서 스페로이드를 세 번 세척합니다.
다음으로, 실온에서 4분 동안 Dappy 염색 용액30 마이크로리터로 세포를 배양합니다. 이전에 설명한 대로 PBS에서 스페로이드를 한 번 세척합니다. 유리 파스퇴르 파이펫을 사용하여 스페로이드를 유리 슬라이드와 PBS 한 방울에 놓습니다.
레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 10배 배율로 형광 현미경검사법에 의해 스페로이드를 이미지화합니다. Z 스택의 다른 광학 평원에서 스페로이드의 다른 광학 단면을 가져 가라. 불멸의 암 관련 섬유아세포의 호모 스페로이드에 비해 정상 췌장 섬유아세포의 호모 스페로이드의 면역형광 염색의 대표적인 이미지는 분화된 세포에서 알파 3하위단위에 대한 증가신호를 나타낸다.
스페로이드내 세포의 형광 신호는 3D 스페로이드의 Z 스택 이미지와 인테그린 알파 3개의 서브유닛 유전자의 전사 수준으로 정량화되어 qPCR에 의해 결정된다. 이러한 결과의 모든 integrin 알파 3 정상 대응에 비해 불멸의 암 관련 된 섬유 아 세포에서 업 규제. 이것은 integrin 알파 3 베타 하나 췌장 섬유 아 세포 분화에 대 한 마커로 간주 될 수 있습니다 증명.
이 방법은 일반적으로 여분의 세포 매트릭스 강성이 세포 운명을 결정하는 장기 및 암 질량에서 일반적으로 발견되는 자기 조직을 항복하는 데 이상적입니다. 스페로이드 배양은 수량 실시간 PCR 및 전체 세포형과 같은 스페로이드 해리 후 다른 분석 분석 분석과 결합 할 수있는 다재다능한 모델입니다. 스페로이드의 고정에 사용되는 파라포름알데히드는 유해 화학 물질이다.
장갑과 아이 웨어는 보호를 위해 착용해야합니다.
