Fibroblastos de cultivo em tecido tumoral recapitulado esferoide muito melhor do que o sistema 2D comumente usado em plástico rígido. Permite estudar a diferenciação de fibroblastos em um ambiente parecido com um tumor. Neste método, a rigidez do trabalho plástico da cultura celular não influencia na artefatude a diferenciação do fibroblasto.
Em vez disso, a influência da interação da matriz celular na diferenciação induzida pelo tumor do fibroblasto pode ser analisada in vitro. Para iniciar esse procedimento, obtenha a mídia de cultura celular, que é suplementada com FBS inativado de 1%calor e estreptomicina de penicilina de 1%. Além disso, obtenha uma solução de 6 miligramas por mililitro de metilcelulose.
Misture uma parte da metilcelulose com três partes da mídia de cultura celular para preparar a solução de formação de esferoides. Resuspend recém-descongelado fibroblastos normais imortalizados ou outros tipos de células como listado no protocolo de texto na solução de formação de esferoides. Se citocinas ou inibidores de integrin forem incluídos no estudo, adicione esses compostos à suspensão celular, a fim de embebê-los nos esferoides durante sua formação.
Quando for o caso, adicione compostos inibidores juntamente com 10 nanogramas por mililitro de beta 1 TGF para desencadear a diferenciação em fibroblastos normais imortalizados. Distribua 100 microliters da solução de formação de esferoides em cada poço de uma placa multi-bem inferior redonda. Pipeta a solução em cada poço para cima e para baixo várias vezes para misturar.
Em seguida, incubar a placa na incubadora de cultura celular a 37 graus celsius com 5% de dióxido de carbono por 24 horas para permitir que um esferoide seja formado em cada poço. Primeiro, corte a ponta de uma pipeta para ampliar o orifício. Após a conclusão da incubação, use esta pipeta de corte para coletar os esferoides em um tubo de reação de 1,5 mililitro por condição experimental ou por proteína a ser analisada.
Centrifugar os esferoides a 1000 vezes G por cerca de 30 a 60 segundos. Remova cuidadosamente a metilcelulose contendo supernaspeita por pipetação, certificando-se de não perturbar os esferoides pelleted. Um cuidado especial deve ser tomado ao transferir os esferoides para os tubos de reação.
Certifique-se de que você não tem forças de deriva tesouras cortando a ponta. Também é importante que você colete todos os esferoides. Durante a etapa de lavagem, certifique-se de não perder os esferoides por aspiração.
Para lavar os esferoides adicione 50 microliters de um X PBS. Centrífuga a 1000 vezes G por 30 a 60 segundos. Em seguida, remova cuidadosamente o PBS por pipetação.
Dependendo da proteína a ser manchada, fixar os esferoides com 50 microliters de 4% de paraformaldeído e PBS por 20 minutos à temperatura ambiente. Lave os esferoides com PBS como descrito anteriormente. Permeabilize as células com 0,1% tritão X e PBS por quatro minutos em temperatura ambiente.
Em seguida, lave os esferoides em PBS três vezes como descrito anteriormente. Adicione PBS contendo 5%FBS e 2%BSA aos esferoides e incubar à temperatura ambiente por uma hora para bloquear locais de interação proteica não específicas. Agora, incubar os esferoides com 30 microliters de anticorpos primários e PBS com 2,5% FBS e 1%BSA a quatro graus celsius durante a noite.
No dia seguinte, lave os esferoides na PBS três vezes como descrito anteriormente. Depois disso, incubar os esferoides com 30 microliters de anticorpos secundários e PBS com 2,5% de FBS e 1%BSA em temperatura ambiente por 90 minutos. Lave os esferoides em PBS três vezes como descrito anteriormente.
Em seguida, incubar as células com 30 microliters de solução de coloração Dappy por quatro minutos em temperatura ambiente. Lave os esferoides em PBS uma vez como descrito anteriormente. Usando uma pipeta pasteur de vidro, coloque os esferoides em uma lâmina de vidro e uma gota de PBS.
Use um microscópio de varredura a laser para imagem dos esferoides por microscopia de fluorescência em uma ampliação de 10 vezes. Tome diferentes seções ópticas transversais do esferoide em diferentes planícies ópticas da pilha Z. Uma imagem representativa da coloração imunofluorescente dos homo esferoides de fibroblastos pancreáticos normais em comparação com os homo spheroids de fibroblastos imortalizados associados ao câncer mostra um sinal aumentado para a subunidade alfa três nas células diferenciadas.
O sinal de fluorescência das células no esferoide são então quantificados com as imagens da pilha Z do esferoide 3D e os níveis transcricionais do gene subunidade alfa três integrin são determinados por qPCR. Todos esses resultados demonstram que o alfa três integrino é regulado em fibroblastos associados ao câncer imortalizado em comparação com a contrapartida normal. Isso prova que o alfa três beta integrin pode ser considerado um marcador para a diferenciação de fibroblastos pancreáticos.
Este método é idealmente adequado para capitular o auto tecido geralmente encontrado em órgãos e massas cancerígenas onde a rigidez da matriz celular extra determina o destino celular. A cultura dos spheróides é um modelo versátil que pode ser combinado com outros ensaios analíticos após a dissociação esferoide, como quantidade de PCR em tempo real e citometria completa. Paraformaldeído usado para fixação dos esferoides é um agente químico perigoso.
Luvas e desgaste dos olhos devem ser usados para proteção.
