スフェロイドの線維芽細胞を培養すると、硬いプラスチックで一般的に使用される2Dシステムよりもはるかに優れた腫瘍組織が再現されます。これは、腫瘍のような環境で線維芽細胞分化を研究することができます.この方法では、細胞培養プラスチック加工の剛性は、線維芽細胞分化に実際に影響を与えない。
代わりに、線維芽細胞の腫瘍誘導分化に対する細胞マトリックス相互作用の影響を、インビトロで分析することができる。この手順を開始するには、細胞培養培地を得て、MEMは1%熱不活化FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを補充する。また、1ミリリットルのメチルセルロース溶液につき6ミリグラムを得る。
メチルセルロースの一部を細胞培養培地の3部と混合し、スフェロイド形成液を調製する。解凍し直した不死化正常線維芽細胞または他の細胞タイプを再懸濁し、スフェロイド形成溶液のテキストプロトコルに記載されている。サイトカインまたはインテグリン阻害剤が研究に含まれている場合は、これらの化合物を細胞懸濁液に加えて、形成中にスフェロイドに注入します。
適切な場合には、TGF β1の1ミリリットル当たり10ナノグラムと共に阻害剤化合物を添加し、不死化正常線維芽細胞で分化を引き起こす。100マイクロリットルのスフェロイド形成溶液を、ラウンドボトム96マルチウェルプレートの各ウェルに分配します。各ウェルの溶液を数回上下にピペットして混合する。
次いで、細胞培養インキュベーターにプレートを摂氏37度で24時間5%の二酸化炭素でインキュベートし、各ウェルに1つのスフェロイドを形成させる。まず、ピペットチップの端部を切り落とし、オリフィスを拡大します。インキュベーションが完了した後、このカットピペットを使用して、分析する実験条件またはタンパク質ごとに1つの1.5ミリリットル反応チューブにスフェロイドを収集します。
約30〜60秒間Gの1000倍の回転楕円体を遠心分離する。ペレット化したスフェロイドを乱さないようにピペット処理することにより、上清を含むメチルセルロースを慎重に除去します。回転楕円体を反応管に移す際には特別な注意が必要です。
先端を切ってせん断ドリフト力を持っていないか確認してください。また、すべての回転楕円体を収集することも重要です。洗浄工程中に、吸引によって回転楕円体を失わないようにしてください。
スフェロイドを洗浄するには、XPBS1個の50マイクロリットルを加える。遠心分離機はGの1000倍で30~60秒間。その後、慎重にピペット処理によってPBSを除去します。
染色するタンパク質に応じて、4%パラホルムアルデヒドの50マイクロリットルとPBSを室温で20分間固定します。前述のようにPBSでスフェロイドを洗浄します。0.1%トリトンXとPBSで細胞を室温で4分間透過させます。
次いで、先に述べたようにPBSでスフェロイドを3回洗浄する。5%FBSおよび2%BSAを含むPBSをスフェロイドに加え、室温で1時間インキュベートして非特異的タンパク質相互作用部位をブロックします。今度は、一次抗体の30マイクロリットルとPBSのスフェロイドを2.5%FBSと1%BSAを摂氏4度で一晩インキュベートします。
翌日、先に述べたようにPBSでスフェロイドを3回洗浄する。この後、2次抗体の30マイクロリットルとPBSのスフェロイドを室温で2.5%FBSおよび1%BSAで90分間インキュベートします。前述のとおりにPBSでスフェロイドを3回洗浄します。
次に、30マイクロリットルのダッピー染色液を室温で4分間インキュベートします。前述のようにPBSでスフェロイドを1回洗います。ガラス製のパスツールピペットを使用して、ガラススライドとPBSのドロップに回転楕円体を置きます。
レーザー顕微鏡を使用して、蛍光顕微鏡による回転楕円体を10倍の倍率で画像化します。Zスタックの異なる光学平野で、スフェロイドの異なる光学断面を取る。正常膵臓線維芽細胞のホモスフェロイドの免疫蛍光染色の代表的な画像は、不死化癌関連線維芽細胞のホモスフェロイドと比較して、分化された細胞におけるα3サブユニットに対するシグナルの増加を示す。
次いで、スフェロイド中の細胞の蛍光シグナルを3DスフェロイドのZスタック画像で定量化し、インテグリンα3サブユニット遺伝子の転写レベルをqPCRによって決定する。これらの結果のすべては、インテグリンα3が正常な対応と比較して不死化癌関連線維芽細胞においてアップレギュレートされていることを示す。これは、インテグリンα3β1が膵線維芽細胞分化のためのマーカーと考えることができることを証明する。
この方法は、細胞の固さが細胞の運命を決定する臓器および癌塊に一般的に見られる自己組織をキャピテーションするのに理想的である。スフェロイド培養は、量のリアルタイムPCRや完全なサイトメトリーなどのスフェロイド解離後の他の分析アッセイと組み合わせることができる汎用性の高いモデルです。スフェロイドの固定に使用されるパラホルムアルデヒドは、有害な化学薬品です。
手袋とアイウェアは保護のために着用する必要があります。
