Burada tanımladığımız yöntemler, araştırmacıların alpakalarda tek etki alanı antikorları üretmesine yardımcı olmak için NIH COBRE sponsorluğundaki University of Kentucky Protein Core Facility tarafından benimsenmiştir. Tek etki alanı antikorları biyomedikal araştırmalarda anahtar soruları cevaplamak için kullanılan önemli bir araçtır. Gösterdiğimiz tekniklerin en büyük avantajı, tek bir alpakada beş farklı proteine kadar tek etki alanı antikor üretimine olanak sağlamasıdır.
Bu tekniğin etkileri insan sağlığı ve hastalık tedavisine kadar uzanır, çünkü bu tek etki alanı antikorları tedavi amaçlı, aşı olarak ve tanı olarak kullanılabilir. En köklü biyomedikal müfettişleriçin en önemli engel alpaka gibi büyük hayvanlar, ele olduğunu. Bir alpaka işleme Görsel gösteri, antijen enjeksiyonu, ve kan toplama, bu camelids tek etki alanı antikorların başarılı üretimi için önemlidir.
Prosedürü gösteren Doktor Jeff Smiley, Üniversite Veteriner, Bayan Kathy Boaz, Veteriner Teknisyen ve Bayan Erin Jones, Lab Hayvan Teknisyeni olacaktır. Kanın kullanımı, Araştırma Görevlisi Doktor Martin Chao tarafından gösterilecek. Bu prodüksiyonun gerçek hikayeleri Blue Eyes, Big Boy, ya da sevgiyle Gorilla olarak bilinen ve Freddie, bizim Kentucky alpaka vardır.
Başlamak için, bir halter ve kurşun ile hayvan dizginlemek. Sonra alpakanın saçını, boynundan omuza kadar hilal ay deseni içinde elektrikli makaslarla kırpın. Dikkatle baş ve boyun tarafından alpaka tutun ve yavaş yavaş boyun tabanı boyunca bir 22 gauge iğne ile subkutan antijenler enjekte, yay lenf düğümleri yakın.
Her biri yaklaşık beş santimetre arayla yaklaşık 200 mikrolitrelik beş enjeksiyon gerçekleştirin. Bundan sonra, anafilaksi belirtileri için yaklaşık 20 dakika hayvan izlemek. Enjeksiyon bölgesini haftalık olarak lokalize inflamasyon için inceleyin.
Kan almak için, alpaka nın saçını kırpın ve toplama alanını alkol bezleriyle dezenfekte edin. Alpaka hafifçe dizginlemek, boyun dik ve düz tutulur sağlanması. Vertebranın enine prosesinin ventral projeksiyonlarını bir dönüm noktası olarak kullanarak, ventral proseste sadece medial basınç uygulayarak damarı tıka.
Daha sonra, 45 derecelik bir açıyla iğne takın, biraz projeksiyon medial, boyun merkezine doğru. Kan akana kadar iğneyi manipüle edin. İlk olarak, toplanan kanın 15 mililitresini beş mililitre PBS ile seyreltin.
Sonra, bir lenfosit ayırma tüpü içine pipet kan periferik kan lenfositler izole etmek, veya PBLs, yoğunluk gradyan santrifüj yoluyla. Üst plazma tabakasını yavaşça çıkarın ve ayrı bir tüpe kaydedin. Daha sonra, pbl tabakasını hafifçe çıkarın ve steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.
PBLs için önceden soğutulmuş PBS 45 mililitre ekleyin ve 800 kez G 20 dakika için tüp spin ve dört derece santigrat. Lenfositler içeren pelet bırakarak, bir pipet ile supernatant çıkarın. PBL'leri RNA izolasyonu için hazırlamak için peleti beş mililitre önceden soğutulmuş PBS ile iki kez daha yıkayın.
Bu protokol kullanılarak, bir dizi protein antijenine karşı tek etki alanı antikorları üretildi. Bağışıklık takibi, antijenlerin çoğunluğunun üç haftadan itibaren güçlü bir yanıt gösterdiğini ve kan almak için en uygun sürenin altı hafta olduğunu göstermiştir. Pozitif kolonilerin dizilimi, farklı antijenler için farklı tek etki alanı antikor dizileri tespit etti.
Örneğin, üç benzersiz koloniler referans antijen maltoz bağlayıcı protein izole edildi. Genellikle, tek etki alanı antikorları önemli dizi çeşitliliği ve antijen bağlayıcı döngülerin son derece değişken uzunlukta içeriyordu. Bu özellikler özellikle tek etki alanı antikor antijen etkileşimlerinde önemlidir.
Bu prosedür hayvan başına en fazla beş antijen için tek etki alanı antikorüretimi sağlar. Her hayvan için tek bir kan toplama ve kütüphane inşaatı kullanılmaktadır. Faj ekran tabanlı seçim antijen özgü, tek zincirli antikorlar tanımlamak için kullanılır.
Antijen enjeksiyonları ve kan örnekleme yaparken, onları daha sakin tutan bir grupta alpaka tutmak önemlidir. Bu, durduranlar ve müşteri adayları kullanılarak ve yordamlar sırasında yakın bir şekilde bağlanabilir.
