Çekiş kuvveti mikroskobu hücre tarafından oluşturulan kuvvetleri ölçmek için kullanılır. Bu protokol, deneyimsiz kullanıcılar için daha erişilebilir hale getirmek için çekiş gücü verilerinin toplama analizini kolaylaştırır. Mevcut referanssız çekiş kuvveti mikroskobik platformlar azerindebu tekniğin en büyük avantajı, multifoton litografinin bireysel deneysel ihtiyaçlara göre hızlı ve kolay desenleme ayarı yeniden tasarlamasına olanak sağlamasıdır.
Bu yeni referanssız çekiş platformunun oluşturulması nda ve uygulanmasında, yalnızca metin yerine görsel gösterim yoluyla anlaşılması daha kolay birçok önemli adım vardır. Baz hidrojel fotopolimerizasyonu için, ilk perfloroalkoxy alkanlar ince, düz levha üzerine pre-polimer solüsyon üç mikrolitre ekleyin ve düz yerleştirin 150 mikrometre kalınlığında PDMS şeritler çevreleyen, ancak temas değil, ön polimer çözelti damla. PDMS'nin üzerine, ön polimer damlacık kapağının altına ortalanmış ön polimer damlacıkile PDMS boşluklarının kalınlığına kadar polimer öncesi damlacık düzleştirin.
Sandviç öncesi polimer çözeltisini UV ışığına yaklaşık bir dakika maruz bırakın. Bir hidrojel tam olarak oluştuğunda, kapak kaymasını PDMS boşluklarından dikkatlice ayırın. Kapak kayma açık bir alt Petri çanak takmak için yüksek performanslı çift taraflı akrilik yapıştırıcı kullanın.
Hidrojel yüklü kapak kaymasını Petri kabına yapıştırırken özel dikkat edin. Uygulama sırasında ıslak bir çanak veya çok az basınç sızıntıları oluşturmak için izin verir, örnek berbat. Kapağı, yapıştırıcı ve Petri kabı arasında tam bir mühür oluşturmak için yapışkan temas yüzeyine basınç uygulayın ve camı kırmamaya özen tinleyin.
Hidrojeli durulamak için steril filtrelenmiş PBS kullanın. Daha sonra hidrojel sentezi için hazırlanan laboratuvar çözeltisinin 800 mikrolitresine sekiz mikrolitre NVP ekleyin. İkili görüntüyü dijital maskeye dönüştürmek için MATLAB'ı açın ve runscript'i açıp çalıştırın.
m MATLAB komut dosyası. Dönüştürme için ikili TIF dosyasını seçin ve bölgenin dosyalarını kaydetmek için bir klasör seçin. Seçilen görüntünün mikronlarına istenilen son boyutu girdi.
Giriş görüntüsü bu parametrelere uyacak şekilde ölçeklendirilir ve boyutlandırılır. Tek bir piksel dizisi oluşturmak için, İlgi Alanı Jeneratör Seçenekleri Bölgesinde, Küçük Bölgeler/Tek Pikseller altında Kaldır tik kutusunun işaretlerini kaldırın, Kareler tik kutusunu işaretleyin ve Yatay Kesme Çizgileri altında Kullanımı işaretleyin. Ardından Tamam'ı tıklatın. OVL dosyası önceden belirtilen klasörde bulunur.
Mikroskop yazılımında dosyayı açın ve iki foton lazer tarama litografisi sırasında lazer panjur kontrol istenen bölgeleri yükleyin. Aşağıdaki adımlar en az ışık koşullarında yapılmalıdır. Düşük ışık koşullarında fiducial marker dizilerinin imalatı için, önceden hazırlanmış NVP laboratuvar çözeltisinin 200 mikrolitresini 20 miligram Alexa Fluor 633 ile iyice karıştırın ve hidrojel içeren çanaktan tüm PBS'yi çıkarın.
Peg-633 karışımını hidrojele, taban hidrojelini tamamen kapsayan bir damlacık olarak ekleyin ve Petri kabını mikroskop aşamasının numune tutucuya yükleyin. Daha sonra çanak kapağı ve desen çözeltisi en az 30 dakika boyunca hidrojel içine emmek için izin, ışıktan korunan. Görüntüleme için mikroskobu yapılandırmak için, Alexa Fluor 488'i görselleştirmek için uygun lazerleri ve filtreleri seçin.
PEG-488 sinyalini kullanarak hidrojeli bulun ve dedektörden daha uzun emisyon dalga boylarının toplanmasını engelleyin. XY düzleminde hidrojel in merkezini bulmak için dikey ve yatay karo taramaları kullanın ve bu pozisyonda ki aşamayı sıfır. Hidrojelin yüzeyini bulmak için Z-stack işlevindeki çizgi taramalarını kullanın ve bu konumdaki odağı sıfırla.
Yüzey konumunu belirlemek için xy merkezinden uzak çizgi taramaları tekrarlayarak hidrojel seviye, mikroskop aşaması için set vidaları ayarlayarak, gerektiği gibi. Mikroskop yazılımı çalışma alanı içinde, fotodesen için ayrı bir deneme dosyası oluşturun ve çoklu foton gücünü %1,8'e ve tarama hızını altıya ayarlayın. Piksel başına 0,1 mikrometre piksel boyutu ve 100'e bir en boy oranı elde etmek için görüntü çerçevesi nin ve piksellerin boyutunu ayarlayın ve bölgeler dosyasını bölgenin sekmesine yükleyin.
Z-stack işlevini elde etmek ve açmak için tüm bölgeleri ayarlamak için bir makro kullanın. Toplam derinliği 28 mikrometre ve toplam dokuz Z dilimi sayısı için aralığı 3,5 mikrometreye ayarlayın. Ardından, fiducial marker dizilerinin fotodesenli olacağı hidrojel üzerinde belirli konumları ayarlamak için Pozisyonlar işlevini kullanın.
Bekletme süresi 30 dakikalık hedefe yaklaştıkça, sıfırlanmış odak pozisyonuna göre yüzeyin konumundaki değişikliklere bağlı olarak şişme olup olmadığını kontrol etmek için her beş dakikada bir hidrojel yüzeyinin ardışık Z-stack çizgi taramalarını elde edin. Beş dakikalık aralıkta yüzey konumunda herhangi bir değişiklik meydana gelmemişse, desenayarlarını çalıştırın ve hidrojel yüzeyinin desenleme sırasında hareket etmediğini doğrulamak için 488 nanometre lazeri kullanın. Daha sonra hidrojeli mikroskoptan çıkarın, PEG-633 çözeltisini Petri kabından aspire edin ve kabı steril filtrelenmiş PBS ile durulayın.
Bir hücre ve fiducial marker görüntüleri elde etmek için, desenli alanları bulmak için Petri kabını örnek tutucuya döndürün. İlgi çekici bir hücre bulun ve hücrenin iletilen veya floresan görüntüsünü elde edin. Daha sonra gösterildiği gibi hücrenin altındaki desenli diziden bir Z-yığını edinin ve hücrenin ikinci bir iletilen veya floresan görüntüsünü elde edin.
Bir görüntü yığını toplarken, ortaya çıkan görüntüler, görüntü yığını içindeki Z konumunun bir fonksiyonu olarak yoğunlukta salınım yapan düzenli bir desenli özellik dizisi göstermelidir. İzleme. m komut dosyası, ön işleme kalitesini değerlendirmek için floresan fiducial işaretleyicilerin Z-projeksiyonu, algılanan santrioitlerin bir çizimi, nesne algılama kalitesini değerlendirmek için Z konumunun bir fonksiyonu olarak kodlanmış renk ve nesne izleme kalitesini değerlendirmek için Z yönünde sütunlara bağlanan tespit edilen işaretçi santriomlarını temsil eden parçaların çizimi de dahil olmak üzere çeşitli tanısal görüntüler sağlar.
DISP 3D.m komut dosyası, güvenilir işaretçi yoğunluğu profillerinin kalitesini değerlendirmek için belirli bir görüntü yığınında algılanan özelliklerin her sütunu için Z konumunun bir fonksiyonu olarak bir yoğunluk çizimi sağlar. Her ikisi de DISP 3D.
m ve DISP makası. m birlikte kartezyen koordinat boyutlarının her birinde ölçülen yer değiştirme gürültüsünün histogramlarını ve yer değiştirmenin enterpolasyonlu ısı haritalarını sağlar. Buna ek olarak, interp final3D_2.
m, dış kaynaklı kod kullanılarak hesaplanan yüzey çekişlerinin ısı haritalarını sağlar. Bu işlem sırasında hatırlanması gereken en önemli şey, LAP içeren çözeltilerin ışığa duyarlı olduğu ve ortam ışığı kaynaklarından mümkün olduğunca korunması gerektiğidir. NVP'nin uçucu bir organik bileşik olduğunu ve her zaman kimyasal akış kaputunda ele alınması gerektiğini unutmayın.
