Die Traktionskraftmikroskopie wird verwendet, um zellgenerierte Kräfte zu messen. Dieses Protokoll vereinfacht die Erfassung von Traktionskraftdaten, um sie für unerfahrene Benutzer zugänglicher zu machen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden referenzfreien Traktionskraftmikroskopieplattformen besteht darin, dass die Multiphotonenlithographie eine schnelle und einfache Mustereinstellung ermöglicht, die den individuellen experimentellen Bedürfnissen entspricht.
Es gibt viele wichtige Schritte bei der Herstellung und Implementierung dieser neuen referenzfreien Traktionsplattform, die durch visuelle Darstellung leichter zu verstehen sind als durch Text allein. Zur Photopolymerisation des Basishydrogels zunächst drei Mikroliter der Vorpolymerlösung auf eine dünne, flache Platte perfluoralkoxyalkane geben und flache 150 Mikrometer dicke PDMS-Streifen um den Tropfen der Vorpolymerlösung umgeben, aber nicht in Kontakt mit ihm platzieren. Legen Sie einen acrylat-silanisierten Deckelschlupf auf das PDMS, wobei das Vorpolymer-Tröpfchen unter dem Deckschein zentriert ist, um das Vorpolymertröpfchen auf die Dicke der PDMS-Abstandshalter abzuflachen.
Setzen Sie die Sandwich-Vorpolymerlösung für etwa eine Minute UV-Licht aus. Wenn ein Hydrogel vollständig ausgebildet ist, trennen Sie den Deckelrutsch vorsichtig von den PDMS-Abstandshaltern. Verwenden Sie hochleistungsstarken doppelseitigen Acrylkleber, um eine offene Petrischale am Deckel zu befestigen.
Achten Sie besonders darauf, wenn Sie den hydrogelbeladenen Deckelrutsch an der Petrischale anbringen. Eine nasse Schale oder zu wenig Druck während der Anwendung lässt Leckagen entstehen und ruiniert die Probe. Drücken Sie auf die Klebekontaktfläche, um eine vollständige Abdichtung zwischen Deckel-, Klebstoff- und Petrischale zu schaffen, wobei darauf geachtet wird, das Glas nicht zu knacken.
Verwenden Sie steril gefilterte PBS, um das Hydrogel zu spülen. Dann fügen Sie acht Mikroliter NVP zu 800 Mikroliter der Laborlösung für die Hydrogelsynthese vorbereitet. Um ein binäres Bild in eine digitale Maske zu konvertieren, öffnen Sie MATLAB, und führen Sie das runscript aus.
m MATLAB-Skript. Wählen Sie die binäre TIF-Datei für die Konvertierung aus, und wählen Sie einen Ordner aus, um die Dateien der Region zu speichern. Geben Sie die gewünschte endgültige Größe in Mikrometern des ausgewählten Bildes ein.
Das Eingabebild wird skaliert und bemaßt, um diesen Parametern zu entsprechen. Um ein einzelnes Pixelarray zu erstellen, deaktivieren Sie in den Generatoroptionen "Region of Interest" das Kontrollkästchen "Tic entfernen" unter Kleine Regionen/Einzelne Pixel, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Quadrate und deaktivieren Sie die Option Verwenden unter Horizontale Bruchlinien. Klicken Sie dann auf OK. Die OVL-Datei befindet sich im zuvor angegebenen Ordner.
Öffnen Sie die Datei in der Mikroskop-Software und laden Sie die gewünschten Bereiche, die den Laserverschluss während zweiphotonen Laserscanning Lithographie gesteuert. Die folgenden Schritte sollten unter Bedingungen mit minimalem Licht durchgeführt werden. Für die Herstellung von fiducial Marker-Arrays bei schlechten Lichtverhältnissen 200 Mikroliter der zuvor vorbereiteten NVP-Laborlösung mit 20 Milligramm Alexa Fluor 633 gründlich mischen und alle PBS aus der Schale entfernen, die das Hydrogel enthält.
Fügen Sie das PEG-633-Gemisch als Tröpfchen, das das Basishydrogel vollständig umfasst, in das Hydrogel einundund- und laden Sie die Petrischale auf den Probenhalter der Mikroskopstufe. Dann bedecken Sie die Schale und lassen Sie die Musterlösung in das Hydrogel für mindestens 30 Minuten einweichen, vor Licht geschützt. Um das Mikroskop für die Bildgebung zu konfigurieren, wählen Sie die geeigneten Laser und Filter zur Visualisierung von Alexa Fluor 488 aus.
Suchen Sie das Hydrogel mit dem PEG-488-Signal und blockieren Sie die Erfassung längerer Emissionswellenlängen aus dem Detektor. Verwenden Sie vertikale und horizontale Kachelscans, um die Mitte des Hydrogels in der XY-Ebene und null die Stufe in dieser Position zu lokalisieren. Verwenden Sie Linienscans in der Z-Stack-Funktion, um die Oberfläche des Hydrogels zu lokalisieren und den Fokus in dieser Position zu null.
Nivellieren Sie das Hydrogel, indem Sie die Linienscans vom XY-Mittelpunkt entfernen, um die Oberflächenposition zu identifizieren, und passen Sie die eingestellten Schrauben für die Mikroskopstufe nach Bedarf an. Erstellen Sie im Arbeitsbereich der Mikroskopsoftware eine separate Experimentierdatei für die Fotomusterung und stellen Sie die Multi-Photonenleistung auf 1,8 % und die Scangeschwindigkeit auf sechs ein. Passen Sie die Größe des Bildrahmens und der Pixel an, um eine Pixelgröße von 0,1 Mikrometer pro Pixel und ein Seitenverhältnis von 100 zu eins zu erreichen, und laden Sie die Regionsdatei in die Registerkarte der Region.
Verwenden Sie ein Makro, um alle Bereiche festzulegen, die die Z-Stack-Funktion abrufen und aktivieren möchten. Stellen Sie den Abstand auf 3,5 Mikrometer für eine Gesamttiefe von 28 Mikrometern und eine Gesamtanzahl von Z-Slices von neun ein. Verwenden Sie dann die Positions-Funktion, um bestimmte Positionen auf dem Hydrogel festzulegen, an denen die fiduzialen Marker-Arrays fotomustert werden.
Wenn sich die Einweichzeit der 30-Minuten-Marke nähert, erhalten Sie alle fünf Minuten aufeinanderfolgende Z-Stack-Linienscans der Oberfläche des Hydrogels, um auf Schwellungen basierend auf Veränderungen in der Position der Oberfläche relativ zur Nullfokusposition zu überprüfen. Wenn sich die Oberflächenposition im Fünf-Minuten-Intervall nicht geändert hat, führen Sie die Mustereinstellungen aus, und verwenden Sie den 488-Nanometer-Laser, um zu überprüfen, ob sich die Oberfläche des Hydrogels während der Musterung nicht bewegt hat. Dann entfernen Sie das Hydrogel aus dem Mikroskop, aspirieren Sie die PEG-633 Lösung aus der Petrischale und spülen Sie die Schale mit steril gefiltertem PBS.
Um eine Zelle und fiducial Marker-Bilder zu erfassen, geben Sie die Petrischale an den Probenhalter zurück, um die gemusterten Bereiche zu lokalisieren. Suchen Sie eine Zelle von Interesse und erfassen Sie ein übertragenes oder fluoreszierendes Bild der Zelle. Erfassen Sie dann einen Z-Stack des gemusterten Arrays unter der Zelle, wie gezeigt, und erfassen Sie einen zweiten Satz übertragener oder fluoreszierender Bilder der Zelle.
Beim Sammeln eines Bildstapels sollten die resultierenden Bilder ein regelmäßiges Array gemusterter Features anzeigen, die in der Intensität als Funktion der Z-Position innerhalb des Bildstapels oszillieren. Das Tracking. m-Skript bietet mehrere diagnostische Bilder, darunter eine Z-Projektion der fluoreszierenden Fiduzialenmarker zur Bewertung der Vorverarbeitungsqualität, ein Diagramm der erkannten Zentroide, eine Farbe, die als Funktion der Z-Position kodiert ist, um die Objekterkennungsqualität zu bewerten, und ein Diagramm der Spuren, die die erkannten Markerzentroide darstellen, die in Spalten in Z-Richtung verknüpft wurden, um die Objektverfolgungsqualität zu bewerten.
Das DISP 3D.m-Skript bietet eine Intensitätsdarstellung als Funktion der Z-Position für jede Spalte der erkannten Features in einem bestimmten Bildstapel, um die Qualität der profilierten Markerintensitätsprofile zu bewerten. Beide DISP 3D.
m und DISP Schere. m zusammen liefern Histogramme des gemessenen Verschiebungsrauschens in jeder der kartesischen Koordinatenmaße sowie interpolierte Heatmaps der Verschiebung. Darüber hinaus final3D_2 die interp.
m liefert Wärmekarten der Oberflächentraktionen, die mit dem ausgelagerten Code berechnet werden. Das Wichtigste, was man sich bei diesem Verfahren merken sollte, ist, dass Lösungen, die LAP enthalten, lichtempfindlich sind und so weit wie möglich vor Umgebungslichtquellen geschützt werden sollten. Denken Sie daran, dass NVP eine flüchtige organische Verbindung ist und immer in einer chemischen Durchflusshaube behandelt werden sollte.
