Bu in vitro maruzkalma sistemi kullanarak ALI ekili insan akciğer hücreleri açığa tarafından akut pulmoner sitotoksisite ile ilgili hava parçacıklarının taranması hayvan deneylerini azaltmaya yardımcı olabilir. Bu maruz kalma sisteminin en büyük avantajı, homojen bir dağılıma yol açan radyal aerosol dağılım konsepti ve parçacıkların hücrelere konumlandırılmasıdır. Hücreleri tohumlamadan önce, altı kuyu plakaher kuyuya temperli büyüme orta 2,5 mililitre ekleyin.
Hücre kültürünü, hücre içermeyen eklerin kuyuların içine dikkatlice yerleştirin ve her hücre kültürü eklemek için bir mililitre büyüme ortamı ekleyin. Plakaları 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 30 dakika kuluçkaya yatırın. Hücrelerin tripsinizasyonundan sonra, 10 mililitre izotonik çözelti ile dolu bir bardakta hücre kültürünün 100 mikrolitresini seyreltin.
Sallamadan bardağı yavaşça yatırın. Bir hücre sayacında, A549 hücrelerinin hücreye özgü ölçüm parametrelerini temel alan mililitre başına canlı hücre sayısını ve hücre canlılığını belirleyin. Plaka nın yumuşadıktan sonra, hücre kültürü içinde orta aspire ekler ve her hücre kültürü eklemek mililitre başına beşinci hücrelere üç kez 10 yoğunluğu ile A549 hücrelerinin bir mililitre tohum.
Hücre süspansiyonuna hafif çesitli sallayarak ve kuluçkaya yatırarak 24 saat boyunca dağıtın. Basının ön tarafındaki zaman kontrolü ile basma süresini ayarlayın. Basınçlı hava vanası ile basınçlı hava beslemesini açın.
Basının ön tarafındaki basınç regülatörü kullanarak, basınçlı hava basıncını yaklaşık iki bara ayarlayın. Çekmeceyi çekin, Basın düğmesine basın ve dijital basınç düğmesine basma baskısını okuyun. Madde kabını az miktarda test maddesi ile doldurun.
Dalgıç madde kabına yerleştirin ve tozu konteynerde eşit olarak dağıtmak için hafifçe ileri geri çevirin. Madde kabını, pistonlu olarak çekmeceye yerleştirin ve Basın düğmesine basın. Çekmeceyi açın ve pistonu çıkarın.
Kritik bir adım, kararlı partikül maruziyetleri sağlamak için madde kabı içindeki toz keke özel olarak sıkıştırılması gereken test maddelerinin preslenmesidir. Giriş adaptörlerini ve kondensrefleyi aerosol kılavuz modülünden çıkarın. Aerosol kılavuz modülündeki üç aerosol besleme deliklerini fişlerle ve örnekleme modülündeki orta besleme bağlantılarını sahte kapaklarla kapatın.
Vakum hatlarını aerosol kılavuz modülünün tüp konektörüyle bağlayın. Modülü kapatmak ve akış kontrolörlerinin değerini ölçmek için el tekerleğini kullanın. Kapanıştan birkaç dakika sonra, değerler dakikada beş mililitrenin altına düşer.
Aerosol jeneratör yazılımını başlatın. Madde kazıyıcı en düşük konumda değilse, Homing Modu düğmesine basın. Madde kabını preslenmiş test malzemesi ile madde kazıyıcının üzerine ters çevirin.
Madde kabının camının öne dönük olduğundan emin olun. Kilitleme plakasını madde kabının üzerine yuvaya yerleştirin ve siyah vidayı sıkın. Özet Akışı ve Döndürme değerlerini istenilen ayarlarla değiştirin.
Madde kazıyıcı preslenmiş madde yakın olana kadar madde konteyner ile slayt aşağı itmek için aşağı oklar kullanın. Basınçlı hava kaynağını aerosol jeneratörüne kütle akış kontrolörüne dokunarak açın ve Başlat düğmesine tıklayarak aerosol üretimini başlatın. Uzun bekleme sürelerinden kaçınmak için besleme hızını saatte 15 ila 20 milimetreye ayarlayın.
Elutriator cam tüp arkasından aşağıdan konumlandırılmış küçük bir el feneri ile ince toz bulutu gözlemleyerek doğru parçacık üretimi kontrol edin. Önceden ısıtılmış pozlama ortamıile orta kaynağı çalıştırın ve modül açıkken alt borular kapsana kadar örnekleme modüllerini doldurun. Pozlama modülüne kör hücre kültürü ekler, alt borular orta ile kaplı ve kesici uçların alt tarafı orta ile temas edene kadar pozlama ortamı aşağı pompalayın.
Aerosol jeneratörünü çalıştırın, pozlama modülünü kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına bağlayın. Kurşun süresinden 30 dakika sonra, elutriatörün pozlama modülü çıkışını kauçuk bir fiş ile kapatın ve kör kesici uçları çıkarın. Alt borular orta ile kapsana kadar pozlama ortamını yeniden doldurun.
Cımbız yardımıyla altı kuyu plakasından hücre kültürü ekler çıkarın. Hücre kültüründen büyüme ortamını dikkatlice dökün, uçları devirerek sokulur ve artık sıvıyı aspire etmek ve atmak için bir pipet kullanın. Kesici uçları hem pozlama hem de temiz hava modüllerinin pozlama odalarına yerleştirin.
Modülleri kapatın ve pozlama modülünü aerosol jeneratörün pozlama modülü çıkışına ve temiz hava modülünü aynı anda taşıyıcı gaz kaynağına bağlayarak pozlama deneylerine başlayın. Deney tamamlandıktan sonra pozlama ve temiz hava modüllerini kapatın ve pozlama modülü çıkışını kapatın. Dur düğmesine tıklayarak basınçlı hava beslemesini ve aerosol jeneratörü durdurun.
Pozlama ve temiz hava modüllerini açın ve hücre kültürünü nisbeten kuluçka sonrası altı kuyu plakasına aktarmak için cımbız kullanın. Altı kuyu plakası ve maruz kalmamış hücre kültürü ekler, 37 santigrat derece ve hava sıvı arayüzünde% 5 karbondioksit 24 saat boyunca kuluçka. Maruz kaldıktan 24 saat sonra, hücre kültürünü yeni hazırlanmış altı kuyu plakaya yerleştirin.
Her hücre kültürü eklemek için taze hazırlanmış WST1 çözeltisi bir mililitre ekleyin. Çözeltiyi hücrelerüzerinde homojen bir şekilde dağıtmak için plakaları dikkatlice sallayın. Hücre kültürü ile altı kuyu plakaları kuluçka 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit bir saat için ekler.
Bundan sonra, her altı kuyu plakasından 96 kuyu plakasına triplicates supernatant 100 mikrolitre aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, 650 nanometre referans dalga boyu ile 450 nanometre olarak emiciölçün. CULTEX RFS, hücrelerin havadaki parçacıklara doğrudan ve homojen bir şekilde maruz kalmasını sağlayan özel olarak tasarlanmış modüler in vitro pozlama sistemidir.
Hücrelerin temiz havaya maruz kalma zaman içinde hücre canlılığı hiçbir azalma yol açar. Maruz kalma sistemi başarıyla doğrulandı ve test edilen bileşiklerin akut inhalasyon tehlikeleri için bir tahmin modeli olarak kurulmuştur. A549 hücrelerinin hiçbir, orta veya güçlü toksisite göstermeyen farklı test maddelerine maruz kalması.
Lütfen kuluçka süreleri, partikül oluşturmanın kurşun zamanı ve partikül biriktirme süreleri olan zaman dilimlerini kesinlikle sakladığından emin olun. Bu pozlama yöntemi öncelikle hücrelerin partikül maruziyeti için tasarlanmıştır, ancak aerosol üretim yöntemi uyarlayarak sıvı aerosoller ve gazların maruz kalma uzatılabilir. Bu tarama yöntemi in vitro akut inhalasyon toksisitesi ile ilgili inhalat parçacıkların nitel değerlendirilmesi sağlar, böylece normalde bu toksikolojik değerlendirme sağlayacak hayvan testleri azaltarak.
Toksik test maddeleri ile çalışan son derece tehlikeli olabilir ve bu tür bileşikleri kullanırken her zaman eldiven, maske takmak gibi önlemler alınması gerektiğini unutmayın.
