El cribado de partículas en el aire relativas a la citotoxicidad pulmonar aguda mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en el ALI utilizando este sistema de exposición in vitro puede ayudar a reducir los experimentos con animales. La principal ventaja de este sistema de exposición es el concepto de distribución radial de aerosoles que conduce a una distribución homogénea y la posición de las partículas en las células. Antes de sembrar las células, añadir 2,5 mililitros de medio de crecimiento templado a cada pozo de una placa de seis pozos.
Coloque las inserciones de cultivo celular sin células cuidadosamente dentro de los pozos y agregue un mililitro de medio de crecimiento a cada inserción de cultivo celular. Incubar las placas durante 30 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de la tripsinización de las células, diluir 100 microlitros de la suspensión del cultivo celular en una taza llena de 10 mililitros de solución isotónica.
Incline la copa lentamente sin agitar. En un contador de celdas, determine el número de células viables por mililitro y la viabilidad celular en función de los parámetros de medición específicos de la celda de las células A549. Después del templado de la placa, aspirar el medio dentro del cultivo celular inserta y siembra un mililitro de células A549 con una densidad de tres veces 10 a las quintas células por mililitros en cada inserto de cultivo celular.
Distribuya la suspensión celular por balanceo suave e incubar durante 24 horas. Ajuste el tiempo de prensado mediante el control de tiempo en la parte frontal de la prensa. Abra el suministro de aire comprimido en la válvula de aire comprimido.
Usando el regulador de presión en la parte frontal de la prensa, ajuste la presión de aire comprimido a aproximadamente dos bar. Extraiga el cajón, pulse el botón Pulse y lea la presión de presión en el interruptor de presión digital. Llene el recipiente de la sustancia con una pequeña cantidad de la sustancia de ensayo.
Inserte el émbolo en el recipiente de la sustancia y gire ligeramente hacia adelante y hacia atrás para distribuir uniformemente el polvo en el recipiente. Coloque el recipiente de la sustancia, con el émbolo, en el cajón y pulse el botón Pulse. Abra el cajón y retire el émbolo.
Un paso crítico es el prensado de sustancias de ensayo que deben comprimirse específicamente en una torta de polvo dentro del recipiente de la sustancia para permitir exposiciones estables a partículas. Retire el adaptador de entrada y el reflector de condensado del módulo de guía del aerosol. Cierre los tres orificios de alimentación de aerosoles en el módulo de guiado de aerosoles con tapones y las conexiones de suministro medio en el módulo de muestreo con aletas ficticias.
Conecte las líneas de vacío con el conector de tubo del módulo de guía del aerosol. Utilice la rueda de mano para cerrar el módulo y medir el valor de los controladores de flujo. Un par de minutos después del cierre, los valores disminuyen por debajo de cinco mililitros por minuto.
Encienda el software del generador de aerosoles. Si el rascador de sustancias no está en la posición más baja, pulse el botón Modo de homing. Coloque el recipiente de la sustancia con el material de ensayo prensado boca abajo sobre el rascador de sustancias.
Asegúrese de que el vaso del recipiente de la sustancia esté orientado hacia el frente. Coloque la placa de bloqueo en la ranura sobre el recipiente de la sustancia y apriete el tornillo negro. Cambie los valores de Feed y Rotation a los ajustes deseados.
Utilice las flechas hacia abajo para empujar hacia abajo el portaobjetos con el recipiente de la sustancia hasta que el rascador de sustancia esté cerca de la sustancia prensada. Abra el suministro de aire comprimido al generador de aerosoles con un toque del controlador de flujo de masa e inicie la generación de aerosoles haciendo clic en el botón Inicio. Establezca la velocidad de avance en 15 a 20 milímetros por hora para evitar largos tiempos de espera.
Controle la generación correcta de partículas observando la nube de polvo fino con una pequeña linterna colocada desde abajo detrás del tubo de vidrio del elutriador. Inicie el suministro medio con un medio de exposición precalentado y llene los módulos de muestreo hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas mientras el módulo esté abierto. Inserte inserciones de cultivo de células ciegas en el módulo de exposición, bombee el medio de exposición hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas con el medio y el lado inferior de las plaquitas esté en contacto con el medio.
Encienda el generador de aerosoles, cierre el módulo de exposición y conecte el módulo de exposición a la salida del módulo de exposición del generador de aerosoles. 30 minutos después del tiempo de entrega, selle la salida del módulo de exposición del elutriador con un tapón de goma y retire las plaquitas ciegas. Vuelva a llenar el medio de exposición hasta que las tuberías descendentes estén cubiertas con un medio.
Retire las inserciones de cultivo celular de las placas de seis pozos con la ayuda de pinzas. Vierta el medio de crecimiento cuidadosamente de las inserciones de cultivo celular despeteando las plaquitas y utilice una pipeta para aspirar y desechar el líquido residual. Coloque las plaquitas en las cámaras de exposición de los módulos de exposición y de aire limpio.
Cierre los módulos e inicie los experimentos de exposición conectando el módulo de exposición a la salida del módulo de exposición del generador de aerosoles y el módulo de aire limpio al suministro de gas portador simultáneamente. Después de completar el experimento, desconecte los módulos de exposición y aire limpio y selle la salida del módulo de exposición. Detenga el suministro de aire comprimido y el generador de aerosoles haciendo clic en el botón Parar.
Abra el módulo de exposición y aire limpio y utilice pinzas para transferir las plaquitas de cultivo celular a las placas de seis pozos preparadas después de la incubación. Incubar las placas de seis pozos, así como los insertos de cultivo celular no explosivos, durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono en la interfaz de líquido de aire. 24 horas después de la exposición, inserte los insertos de cultivo celular en las nuevas placas de seis pozos preparadas.
Agregue un mililitro de la solución WST1 preparada a cada plaquita de cultivo celular. Mece las placas cuidadosamente para distribuir la solución de forma homogénea en las células. Incubar las seis placas de pozo con el cultivo celular insertos durante una hora a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono.
Después de eso, transfiera 100 microlitros del sobrenadante en triplicados de cada placa de seis pozos a una placa de 96 pozos. Con un lector de microplacas, mida la absorbancia a 450 nanómetros con una longitud de onda de referencia de 650 nanómetros. El CULTEX RFS es un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición directa y homogénea de las células a partículas en el aire en la interfaz de líquido de aire.
La exposición de las células al aire limpio no conduce a una disminución de la viabilidad celular con el tiempo. El sistema de exposición fue validado con éxito y establecido como un modelo de predicción para los peligros agudos de inhalación de los compuestos probados. Exposición de células A549 a diferentes sustancias de ensayo que mostraron toxicidad no, media o fuerte.
Asegúrese de mantener estrictamente los plazos que son los tiempos de incubación, el tiempo de entrega de la generación de partículas y los tiempos de deposición de partículas. Este método de exposición está diseñado principalmente para la exposición a partículas de las células, pero puede extenderse a la exposición de aerosoles líquidos y gases mediante la adaptación del método de generación de aerosoles. Este método de cribado permite la evaluación cualitativa de partículas inhalables con respecto a la toxicidad aguda por inhalación in vitro, reduciendo así los ensayos con animales que normalmente proporcionarían esta evaluación toxicológica.
No olvide que trabajar con sustancias de ensayo tóxicas puede ser extremadamente peligroso y las precauciones, como el uso de guantes, una máscara, siempre deben tomarse al manipular dichos compuestos.
